2019 Fiscal Year Research-status Report
Low-cost degradation of azo dyes using the artifitial multi-domain enzymes immobilized on the sheet.
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17K05936
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| Research Institution | Health Sciences University of Hokkaido |
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Principal Investigator |
堀内 正隆 北海道医療大学, 薬学部, 准教授 (90322825)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
永田 崇 京都大学, エネルギー理工学研究所, 准教授 (10415250)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | タンパク質工学 / アフィニティークロマトグラフィー / 固定化酵素 / カードラン / GRP-tag / 融合タンパク質 / アゾ色素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2019年度は，2種類のSortase Aによるグルコキナーゼ (GLK)，グルコース-6-リン酸脱水素酵素 (ZWF) およびアゾレダクターゼ (AZR) の3種類の酵素のプロテインライゲーションの反応条件の改良を試みた．しかしながら，昨年度の収率を上回る反応条件を見出すことはできなかった．そこで今年度は，GRP-tagの下流にGLK，ZWFおよびAZRの遺伝子をすべて融合し，C末端にHis-tagをつけてコンストラクトを構築し，大腸菌を用いた発現を試みた．0.1 mM IPTG存在下，16℃，24時間培養したところ，分子量120 kD のGRP-GLK-ZWF-AZR-His融合タンパク質を生産することに成功した．この融合酵素は，グルコース，ATP，NADP+の存在下で，代表的なアゾ色素であるメチルレッドを効率良く分解することができたことから，3種類の酵素ドメインすべてが機能して，分解カスケードを稼働させていることが確認された．これまでの実験で，酵素ドメイン間にフレキシブルリンカーを挿入すると，さらに分解カスケードの反応速度が向上するというデータが得られていることから，GRP-GLK-ZWF-AZR-His融合タンパク質についても，それぞれの酵素ドメイン間に (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)を3連続させたフレキシブルリンカー (以下 (G4S)3リンカー) を挿入したGRP-GLK-(G4S)3-ZWF-(G4S)3-AZR-His融合タンパク質を生産し，(G4S)3リンカーの有無によるメチルレッドの分解能力を比較することにした．各融合タンパク質をGRP-tagを介してカードランシートに固定化し，単時間あたりのメチルレッドの分解量を比較したところ，(G4S)3リンカーを含む場合の方が含まない場合よりも1.2倍多いという結果が得られた．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究代表者が2019年12月に左足を骨折して歩行困難となり，GRP-GLK-(G4S)3-ZWF-(G4S)3-AZR-His融合タンパク質の追加生産ができなくなってしまった．そのため，分解カスケードのNMRによる解析実験が中断してしまったため．
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| Strategy for Future Research Activity |
研究代表者の骨折が治癒した段階で，GRP-GLK-(G4S)3-ZWF-(G4S)3-AZR-His融合タンパク質の追加生産を行い，アゾ色素の分解カスケードにおける各基質ごとの分解過程を，NMRにより解析する．
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| Causes of Carryover |
研究代表者が骨折により治癒するまで実験ができずに遅延しており，次年度まで延長申請を行なった．そのため，次年度に本年度にやり残したNMR測定を行うための測定菅，安定同位体試薬，タンパク質精製試薬および器具の購入のために消耗品費を，論文投稿のための校正に人件費・謝金およびその他の経費を使用する計画である．
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Research Products
(7 results)
