2019 Fiscal Year Research-status Report
Toward understanding of molecular mechanism underlies adaptive DNA checkpoint system that promotes tumorigenesis
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17K07284
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
古谷 寛治 京都大学, 生命科学研究科, 講師 (90455204)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | チェックポイント / オートファジー / がん / DNA損傷 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
がん細胞の特徴の一つとして、DNA損傷ストレスに対する耐性が挙げられる。がん細胞は、ゲノムDNA上に、ある程度の損傷が生じても細胞増殖を続けることが知られている。その耐性により変異を蓄積し、悪性度の高いがん細胞へと変化することが予想される。我々は研究期間中（2017年）に、DNA損傷ストレスへの耐性を生む機構の一つとして細胞増殖促進キナーゼであるPLK1がゲノムDNA損傷の感知機構（RAD9タンパク質）を抑制し、がん細胞にDNA損傷ストレス下でも増殖停止が起こりにくくなる仕組みが考えられることを報告した (eLife誌、Wakida et al. 2017）。PLK1のがん細胞における高発現は、放射線療法や化学療法に対する抵抗性を生む原因となることが示唆されており、その現象を分子機構として説明する結果と位置付けられた。今年度は、昨年度に引き続き、がんの個別情報を網羅した公共のがん情報データベース解析を用いた解析を並行して行った。データベースより、PLK1の発現の高いがん細胞や、発現の低いがん細胞まで存在することを見出した。次に、PLK1の発現の高いがん細胞ではどういった細胞内環境にあるかを統計的に解析を進めた。PLK1の発現が高いがんにおいてはオートファジー経路が亢進していることを示唆する結果が得られ、昨年度の分子生物学的手法から今年度は細胞生物学的な手法を取り入れ、実験的にPLK1とオートファジー経路の関連を探ることで検証した。オートファジー阻害剤を用いることでPLK1の発現レベルに呼応する形でがん細胞種ごとにDNA損傷ストレスに対する異なった細胞応答が見られた。また、新規の代謝酵素をRAD9複合体因子として同定し、現在は代謝制御もふくめ細胞外環境にまで視野を広げた解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
データベース解析と細胞内のRAD9複合体解析を含む生化学的実験からがゲノムストレス下での細胞増殖亢進に関わる新たな代謝酵素を我々は見出した。同定した代謝酵素とRAD9との相互作用 の詳細な分子解析は進行しつつあり、今夏中には確立した結果を得られると期待している。相互作用情報を利用することで現在、複合体解析から得られた生化学知見の裏付けを取るための実験を並行して行なっている。また、相互作用部位を基にした変異体の取得が進行中である。代謝産物の定量解析は順次進めている。変異体を用いることで定量解析の検証が可能になるほか、データベース解析から得られたオートファジー経路と代謝・DNA損傷応答経路との関わりも含め、ノックダウン実験や阻害剤実験を活用したデータの取得を計画している。ツールとしてPLK1が亢進したがん細胞と亢進していないがん細胞情報も手にしていることが我々のアドバンテージだと考えている。種々のがん細胞種における代謝酵素の発現も含め検討したい。DNA損傷ストレスとがん、代謝制御とがんといった繋がりは報告されてきているが、DNA損傷ストレスと代謝ががんシグナルにおいて協調して働くのか、という点については理解があまりされていない。新たな代謝酵素を見出したことにより、全体の総括が遅れてしまったが、計画していた相互作用因子解析がデータベース解析とあわさることで、当初の期待以上の成果に発展ししつつあると認識している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は同定した代謝酵素とDNA損傷因子RAD9との相互作用をより詳細に検討する。アミノ酸置換変異体の取得を目標とすることで、複合体解析の検証だけでなく、細胞内で発現させることで、代謝変動の定量解析から得られた結果がRAD9との特異的な相互作用の結果起こったのかを検討するツールとして活用する予定である。PLK1が亢進したがん細胞、亢進していないがん細胞において代謝酵素や代謝産物の量的変動がDNA損傷応答時に見られるかを検討する。その際にPLK1の阻害剤、オートファジー阻害剤、また、代謝酵素のRAD9との相互作用欠損変異体を利用する。それにより、代謝変動がPLK1-RAD9のがん細胞適応応答の結果起こりうる事象かどうかを検討可能である。同定した代謝酵素を介した代謝産物がゲノムストレス、あるいはPLK1やRAD9の発現とどのように関連するかを他のがん細胞種も用いながら検討する。代謝酵素の発現が影響を受けるのかも含め、阻害剤や種々のがん細胞を用い、精査し、ゲノムストレスに応じた代謝、リン酸化シグナル経路の変化とオートファジー経路との連携がどのようにしてがん化に伴い変化するかをRasV12によるがん化誘導の系も取り入れることも検討しながら時系列データを取得し解析へと進める。以上の追加実験を行うことで、申請していた、PLK1を介したがん適応応答の分子ネットワークの詳細を、代謝変動という新たな視点からまとめることができるのではないかと期待している。
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| Causes of Carryover |
成果報告の部分でも述べたが、申請書に記載したRAD9の複合体解析を昨年度行なった結果、新たな代謝酵素の同定に至った。この代謝酵素情報から予想された、DNA 損傷応答時に起こる代謝変動を精査しているところである。また、代謝酵素とRAD9タンパク質との相互作用も検証しつつある。研究計画にある、がん適応応答の分子ネットワークの解析の重要な部分にあたる成果であり、研究費の使用を遅らせてでも詳細な結果を得る必要があったと判断したため。具体的にはRAD9と代謝酵素の相互作用のドメイン・部位同定、相互作用ドメイン間での生化学的な検証。変異部位の作成による相互作用の検証。変異部位を導入した細胞におけるがん適応応答の発動の有無。変異部位を導入した細胞における代謝変動、あるいは代謝変動を細胞に課した際の適応応答の発動、PLK1の発現の状況の検出を企画しており、それらの結果を統合することで研究計画にあるように、がん適応応答の分子ネットワークの詳細が明らかになると考えたため。
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| Remarks |
これまでの成果は京都大学大学院生命科学研究科、および大学のHPにて公開してきた。
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