2018 Fiscal Year Research-status Report
Investigation into physical and functional interaction between HUSH complex and RNA
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17K07293
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| Research Institution | National Institute for Basic Biology |
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Principal Investigator |
浜田 京子 基礎生物学研究所, クロマチン制御研究部門, 助教 (90450410)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | クロマチン / RNA / 遺伝子発現制御 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は昨年度の研究でRNA結合能を確認できていたHUSH complexの主な構成因子の一つであるMPP8に焦点を絞って研究を進めた。ヒト培養細胞を用いて、RNA共免疫沈降法とRT-qPCRで既存のHUSH complexのターゲット遺伝子からの転写産物とMPP8の結合を検討したところ、６つのターゲット遺伝子のうち、一つからの転写産物と比較的強く結合していることが分かった。この結果はクロマチン免疫沈降法でMPP8のターゲット遺伝子座への局在を確認した結果とも一致した。興味深いことに、転写伸長を阻害するとターゲット遺伝子座に局在するMPP8レベルが減少することも分かった。また、MPP8をsiRNAを用いてノックダウンしたところ、MPP8の局在が確認できたターゲット遺伝子については２倍以上の脱抑制が見られた。転写伸長を阻害した際にターゲット遺伝子のメチル化ヒストンH3K9のレベルはほぼ変化しないことやヒストンH3K9メチル化酵素、SETDB1をノックダウンしてもターゲット遺伝子の顕著な脱抑制が見られないことから、少なくとも一部のターゲット遺伝子に関して、MPP8がメチル化ヒストンH3K9非依存的分子機構を介して転写を制御していることを示唆することができた。この分子機構を解明するために、MPP8とHUSH complexのもう一つの構成因子であるTASORに対する抗体を用いて共免疫沈降を行い、質量分析法でこれらの因子と結合するタンパク質の網羅的解析を行った。その結果、既存の結合因子の他にSpliceosome構成因子を含む多数のRNA結合因子をMPP8/TASOR結合因子として同定することができた。これらの結果から、MPP8/HUSH complexがRNAや転写過程とカップルした分子機構を介して転写制御に寄与している可能性が示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究を遂行していく過程で当初の予定からアプローチ等を変更する必要があったが、MPP8もしくはHUSH complexによる転写制御に関わる新規の分子機構を見出すことができたと考える。また、これまでの研究結果は、この新規の分子機構にRNAや転写過程そのものが関わることを示唆していることから、今後の研究によってMPP8のRNA結合能、もしくは他のRNA結合因子との相互作用がHUSH complexの転写制御機能にどのように寄与しているのかを解明していく道筋が立てられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
既存のMPP8の局在やノックダウン時の発現の変化の情報は、本研究で使用している細胞では(ほぼ)確認できない・応用できないため、使用している細胞でコントロールとMPP8 siRNAを用いてノックダウンを行い、RNA-seqでMPP8が発現制御に関わっているターゲット遺伝子を同定する。また、これらの細胞から抽出したpolyA+やrRNA depleted RNAを同時に解析することで、MPP8ノックダウン細胞でスプライシングやpre-mRNA processingに変化があるかどうかを検討する。さらに、MPP8やメチル化ヒストンH3K9等に対する抗体を用いてRIPやChIP（もしくは、RIP-seqとChIP-seq)を行い、MPP8に結合するRNAやMPP8とメチル化ヒストンH3K9の局在の関連性についても検討する。メチル化H3K9非依存的なMPP8の局在やノックダウンで脱抑制がみられる遺伝子については、転写やスプライシングを阻害した場合にMPP8の局在や発現レベル・mRNAプロセシングに変化が見られるかどうか、解析を行う。
これらに加え、MPP8ノックダウン細胞で野生型、RNA結合部位の変異型・欠損型MPP8を発現させて、MPP8のRNA結合能が上記の実験で同定したターゲット遺伝子の転写抑制に寄与しているのか否かを解明する。
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