2017 Fiscal Year Research-status Report
非定型RabGAPによるクラスリン非依存性カーゴ蛋白質の細胞内膜輸送制御
| Project/Area Number |
17K07327
|
|---|
| Research Institution | University of Tsukuba |
|---|
Principal Investigator |
船越 祐司 筑波大学, 医学医療系, 助教 (30415286)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | リサイクリングエンドソーム / 細胞内膜輸送 / RabGAP / TBC蛋白質 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
細胞膜蛋白質の細胞内への取りこみ、その後の細胞内輸送は、低分子量G蛋白質RabファミリーやArf6によって制御される。RabやArf6は、GDP結合（不活性）型とGTP結合（活性）型をサイクルする。GDPからGTPへの変換（活性化）はGEFによって、GTPからGDPへの加水分解（不活性化）はGAPによって促進される。
本研究では、RabGAPドメインであるTBCドメインを有しながら、GAP活性に必須のアミノ酸を欠くユニークなRabGAP（非定型RabGAP）に着目し、その機能解析、特にクラスリン非依存性に取り込まれる膜蛋白質（CIEカーゴ）の細胞内輸送における機能を解析する。本年度は、上記のような特長をもつTBC1D3、TBC1D24の解析を行い以下の結果を得た。１）TBC1D3、TBC1D24をHeLa細胞に過剰発現すると、CIE カーゴ蛋白質の輸送経路に特徴的なチューブ様のリサイクリングエンドソーム（TRE）が顕著に増加する。２）TBCドメインに変異を導入したTBC1D3、TBC1D24変異体では、１）でみられた効果が消失あるいは減弱する。３）TBC1D24のノックアウト細胞、TBC1D3をノックダウンした細胞では、TREが減少する。以上の結果より、TBC1D3、TBC1D24は、TREの形成を促進することが示唆された。
さらに、TBC1D3、TBC1D24と相互作用することが報告されているArf6との関係について検討した。Arf6は、CIEカーゴのリサイクリングにおいて主要な役割を果たすことから、TBC1D3、TBC1D24がArf6を介してTREの形成を制御する可能性について検証した。しかしながら、Arf6をノックダウンした細胞においても両者によるTREの増加が認められたことから、両者はArf6以外のエフェクターを介してTREを制御していることが示唆された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、特徴的なGAPドメイン構造をもつ非定型RabGAPに着目し、CIEカーゴ蛋白質の細胞内輸送制御への関与を検証するとともに、そのメカニズムを解明することを目的としている。本年度は、１）予備的知見を得ていたTBC1D3およびTBC1D24のCIEカーゴ蛋白質輸送における機能解析、２）CIEカーゴの輸送に関与する新規非定型RabGAPの同定、を計画していた。前述のように本年度は、TBC1D3、TBC1D24の機能解析を行い、両者がチューブ様リサイクリングエンドソームの形成あるいはCIEカーゴのリサイクリングに関与することを明らかにした。また、平成30年度に予定していたメカニズムの解析を一部実施し、TBC1D3、TBC1D24ともに、相互作用が報告されていたArf6とは異なるエフェクターを介してTREの制御を行っていることを示唆した。さらに、エフェクター分子の候補としてCIEカーゴの輸送に関わるRabファミリーと相互作用を検討し、候補となるRabを同定するなどの予備的知見を得ている。
一方で、TBC1D3、TBC1D24の解析を中心に進めるために、２）の新規RabGAPの同定は予定を変更し平成30年度以降に実施することとした。
以上のように、一部の計画変更はあったものの、本研究課題で計画している実験は概ね順調に実施し、一定の成果を上げていると判断した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
上記のように本年度は、TBC1D3およびTBC1D24がCIEカーゴの輸送に特徴的なチューブ様リサイクリングエンドソームの制御に関わることを明らかにした。残りの2年間は、TBC1D3、TBC1D24による細胞内輸送制御メカニズムの解明、および両者を介した細胞機能の解明を目指し解析を進めていく。また、病態との関連についても検討する予定である。
現在までに、TBC1D3、TBC1D24と相互作用するRabの候補を同定しており、このRabを介してCIEカーゴの輸送を制御するのかの検討、またRabの活性調節を検討する。細胞機能については、TBC1D3、TBC1D24が標的となるCIEカーゴの輸送を制御することにより細胞膜上での発現量を調節し、結果、何らかの細胞機能が調節されていることが想定される。そのため、標的CIEカーゴを同定し、それらの膜蛋白質が調節する細胞機能を手がかりに、TBC1D3、TBC1D24が関与する細胞機能を同定し、そのシグナル経路を明らかにする。
また、CIEカーゴのリサイクリングに関与することを既に報告しているTRE17についても、同様にメカニズム、制御する細胞機能の解明を目指す。既に相互作用因子の探索を実施しており、候補となる因子を同定している。今後は、これらの因子を中心に解析を進めていく。
さらに、上記TBC1D3、TBC1D24、TRE17の他に特徴的なRabGAPドメインをもつ非定型RabGAPが複数あることから、これらのRabGAPについてもCIEカーゴ輸送への関与を検討していく。
|
| Causes of Carryover |
当初予定していた実験計画を一部変更し、平成29年度に予定していた実験を平成30年度以降に実施することにし、その計画に必要な経費を30年度に繰り越したため。
実施を平成30年度以降に変更した実験は、平成30年度中に実施する予定のため、次年度使用額として予定している研究経費は30年度中に使用予定である。
|
