2018 Fiscal Year Research-status Report

Non-centrosomal microtubules that control the structure and function of kidney tubules

Research Project

Project/Area Number	17K07397
Research Institution	Waseda University
Principal Investigator	戸谷美夏早稲田大学, 理工学術院, 講師(任期付) (80455360)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	上皮細胞 / 微小管編成 / 腎臓 / 腎嚢胞 / 微小管マイナス端 / CAMSAP3/Nezha
Outline of Annual Research Achievements	微小管マイナス端に結合するCAMSAP3に変異をもつマウス（Camsap3-dcマウス）が、多発性嚢胞腎を生じることを見出し、解析を行っている。昨年度までの研究において、1) Camsap3変異による嚢胞腎は、尿細管の一部である近位尿細管が拡張して生じること、2) 腎上皮細胞の微小管制御は、小腸上皮細胞とは異なり、CAMSAP3の機能が欠損しても一部の微小管が頂端―基底の配向を保つことを明らかにした。平成30年度は、組織化学的な解析を進め、血液・尿の生化学検査を行い、以下の結果を得た。さらに、Camsap3ノックアウト(KO)マウスの作出が完了し、嚢胞腎の表現型を確認した。 1.腎上皮細胞の微小管の量は、野生型・Camsap3-dcともに、近位尿細管より遠位尿細管で多かった。ダイナミックな微小管の指標となるチロシン化微小管の割合は、野生型に比べてCamsap3-dcの近位尿細管で高い傾向が見られた。 2.細胞増殖マーカーの染色を行った結果、嚢胞を形成する上皮細胞では、細胞分裂が亢進していた。 3.血液・尿の生化学検査を行った結果、Camsap3-dcマウスでは、カリウムおよびマグネシウムの腎臓における再吸収が低下する傾向があった。 4.これまで解析に用いてきたCamsap3-dcマウスは、機能を欠く変異型のCAMSAP3タンパク質を発現する。小腸上皮細胞とは異なり、腎上皮細胞では、Camsap3-dcにおいても一部の微小管が配向を保っていた。このことから、変異タンパク質の表現型への影響を懸念し、Camsap3遺伝子領域を完全に欠失させた、Camsap3 KOマウスの作出を、理化学研究所との共同開発で進めていた。Camsap3KOマウスの作出が完了し、早稲田大学TWInsへの搬入を行った。繁殖を行いながら表現型を確認し、Camsap3KOマウスにおける多発性嚢胞腎の形成を確認した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 組織化学解析、および、生理的機能への影響の検査を、おおむね予定通り進行している。理化学研究所と連携しての新規ノックアウトマウスの共同開発も、おおむね予定通りに完了した。早稲田大学TWInsへの当該マウスの搬入、表現型の確認を予定通り行った。
Strategy for Future Research Activity	1.腎嚢胞を形成する上皮細胞で、細胞分裂の亢進が見られる原因を追求する。細胞形態の変形の様子から、原尿の圧力によって尿細管が膨潤する可能性を考え、物理的な力により活性化する細胞分裂亢進のシグナル経路に着目した実験をおこなう。 2.Camsap3-dcマウスで観察された主要な表現型について、変異型CAMSAP3の発現がないCamsap3KOマウスを用いて、CAMSAP３の機能を確認する実験をおこなう。 3.得られた実験結果を総合的に考察し、非中心体微小管が腎尿細管の構造と機能を制御するしくみについて、論文にまとめる。
Causes of Carryover	Camsap3変異マウス（Camsap3-dcマウス、Camsap3KOマウス）は、繁殖を行いながら、目的の週齢のマウスを得て実験を進めている。実験は継続して行っており、限られたスペースで繁殖を行っている。実験に用いることができる変異マウスの数は、交配の確率、得られる仔マウスの遺伝子型などの影響をうけるため、作製するサンプルの数や時期が前後し、予算の使用時期にも前後が生じる。このため、マウスの飼育管理費用、血液・尿検査用の費用、組織化学試料作成のための試薬、ミクロトームなど学内設備使用料など、継続使用している費用が繰越となった。令和元年度に上記の項目で、使用の予定。