2018 Fiscal Year Research-status Report
Molecular Evolution of diverse RNA kinase family proteins and construction of mutant enzymes based on the evolutionary data
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17K07517
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
金井 昭夫 慶應義塾大学, 環境情報学部(藤沢), 教授 (60260329)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | RNAキナーゼ / 分子進化 / 系統樹 / 機能ドメイン / 実験検証 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Clp1は真核生物で見出されたPolyribonucleotide 5'-hydroxyl-kinaseである。また、Clp1のアミノ酸配列と類似したNol9やGrc3が真核生物の一部に存在する。その一方、これらのClp1 familyタンパク質がいかに進化し、多様化していったのかに関する知見は限られている。本研究は生物の３ドメインを構成するバクテリア、アーキア、真核生物ゲノムを対象として大規模な分子進化解析を実施すると共に、特に原核生物では完全長ゲノムが報告されている生物種に対し、系統学的な分布および頻度解析をおこなった。
結果、Clp1相同タンパク質として3,557件が得られたが、この中には、これまで知られたアーキアや真核生物に由来するものばかりでなく、系統的には分散しながら、限定されたバクテリアに由来するものが少数存在していた。これらClp1相同タンパク質は、生物の３大ドメインの生物種にそれぞれ特有な構造ドメインを有したかたちで多様化していることが明らかとなった。また、Clp1関連タンパク質の配列長は平均約555アミノ酸長であったが、驚いたことに、Clp1 polynucleotide kinase domainを含有した1,000アミノ酸残基以上）の巨大タンパク質が真核生物に122件同定された。これらは新規のマルチドメインタンパク質であった。さらに、バクテリアThermus scotoductus 由来のClp1タンパク質（Ts-Clp1）を用いて、そのリン酸化活性を実験的に解析した。Ts-Clp1は1本鎖RNAオリゴを優先的にリン酸化したが (Km 6 nM)、酵素濃度を高くしてやれば、一本鎖DNAオリゴヌクレオチドもリン酸化の標的とした (Km 130 nM)。Ts-Clp1は極めて耐熱性で、90℃においてもその活性を示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
上記のように考えた理由は、申請段階では全くわからなかった２つの事象を明らかにできたからである。
（１）バクテリアでのClp1該当分子の発見と、世界初となるポリヌクレオチドキナーゼ活性の実験的な検証をおこなったこと。
（２）Clp1 polynucleotide kinase domainを含有した巨大タンパク質の一群を発見したこと。
その一方で、当初計画したキメラ分子を用いて、機能性ドメインの構造活性相関を行う計画を変更せざるを得なかった。この問題に関しては将来の課題として考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
大まかな分子進化研究は終わっているので、情報学的な解析によって見出したバクテリアClp1の実験検証を再確認すると共に、本研究を国際学術雑誌にまとめる方向で、最終年度の総まとめを行いたい。
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| Causes of Carryover |
2018年度において検証実験が終わらなかったために、少額であるが、ある程度の消耗品や薬品を購入する研究費を2019年度に残すため。
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