Development of rapid mapping system, identifing mutant gene loci with the soybean mutant library.

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K07604
• Research Institution: Saga University
• Principal Investigator: 渡邊 啓史 佐賀大学, 農学部, 講師 (40425541)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 穴井 豊昭 佐賀大学, 農学部, 教授 (70261774)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: ダイズ / 遺伝資源 / 突然変異系統 / 遺伝子 / マッピング / 次世代シークエンサー

Outline of Annual Research Achievements

本年度は昨年度作成した次世代シークエンス解析データから取得した、品種間の多型情報を元に、1塩基多型の近接塩基に塩基置換を伴ったプライマーを設計することでPCR断片の融解温度の差分を最適化したDNAマーカー（Nearest neiboring nucleotide substitution HRM marker: NNNs-HRMマーカー）の有用性について検討を行った。次世代シークエンス解析から得られた多型の大部分を、遺伝子型の識別において信頼性の高いDNAマーカーとして変換することが可能になり、ゲノム上の任意の位置にDNAマーカーの設計が容易となった。
ダイズ種子中に含まれるイソフラボンの組成が異なる青黄豆とフクユタカ、球磨地1号とフクユタカの交雑後代を用いたイソフラボン含量のQTL解析において、上記のNNNs-HRMマーカーは、集団を構成する各個体の遺伝子型の解析に支障はなく、遺伝子型解析の大幅な効率化が達成できた。同集団を用いて、マロニルグリシチンの増減に関与する遺伝子座qMgly-11と、マロニルゲニスチンの増減に関与する遺伝子座qMGe-15を同定した。分離集団ならびにダイズ遺伝資源を用いた解析結果から、qMGly-11遺伝子座において、青黄豆型の対立遺伝子が最も効果の大きい対立遺伝子を持つのに対し、フクユタカでは中間型、球磨地1号では欠損型の対立遺伝子を持つことが明らかとなった。
フクユタカ突然変異集団から得られたマロニル化体が減少した変異体と、ダイゼイン系が減少した変異体を対象に、フクユタカとは遺伝的に由来の異なるトヨシロメとの交雑後代を用いたイソフラボン変異体の変異遺伝子をマッピングするために、本課題で構築した高速マッピングシステムの適応が可能かどうか検証した。上記で開発したNNNS-HRMマーカーを用いたバルク分析によって変異遺伝子座を短期間で同定した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ダイズ種子中に含まれるイソフラボンの組成が異なる青黄豆とフクユタカ、球磨地1号とフクユタカの交雑後代を用いたイソフラボン含量のQTL解析によって、染色体11番にマロニルグリシチンの増減に関与する遺伝子座qMgly-11と、染色体15番にマロニルゲニスチンの増減に関与する遺伝子座qMGe-15を同定した。分離集団ならびにダイズ遺伝資源を用いた解析結果から、qMGly-11遺伝子座において、青黄豆型の対立遺伝子が最も効果の大きい対立遺伝子を持つのに対し、フクユタカでは中間型、球磨地1号では欠損型の対立遺伝子を持つことが明らかとなった。現在、次世代シークエンス解析によって両親系統の全ゲノム情報を取得し、 qMGly-11の座上領域に同定される塩基多型情報を用いて候補遺伝子の推定に着手している。
フクユタカ突然変異集団から得られた変異系統と、フクユタカとは遺伝的に由来の異なるトヨシロメとの交雑後代を用いたイソフラボン変異体の変異遺伝子のマッピングについて、マロニル化体が減少した変異体と、ダイゼイン系が減少した変異体を対象に、本課題で構築した高速マッピングシステムの適応が可能かどうか検証した。それぞれの変異体とトヨシロメを交配したF2集団を作成し、F3種子をから抽出したイソフラボン含量を測定した。それぞれの集団から変異体と共通の表現型を示す個体を選抜したところ、どちらの集団においても、変異系統と同様の表現型を示す個体は1/4程度であり、変異遺伝子は劣性1遺伝子によって支配される形質であった。さらにそれぞれの分離集団から選抜した変異個体のDNAを用いて、上記で開発したNNNS-HRMマーカーを用いたバルク分析によって、関与する遺伝子座を同定した。バルク分析では限られた個体を用いることから、従来と比較して遺伝子座の同定に必要な遺伝子型数や労力を大幅に減少させることが可能となった。

Strategy for Future Research Activity

本年度は、引き続き変異体と正常型の交配によって得られた分離集団を用いて、農業形質に関わる新規の遺伝子座のマッピングを進め、本課題で開発した手法が有用であることを証明する事例を蓄積する。また遺伝子座が明らかになった変異系統等は戻し交配等を実施し、育種利用が可能な中間母本の育成に着手するとともに、次世代シークエンス解析を実施して、対象形質に密接に連鎖するDNAマーカーの開発並びに責任遺伝子の同定を試みる。その際、HRMマーカーと次世代シークエンス解析を組み合わせた方法と次世代シークエンス解析のみを用いた場合とで、解析に係る労力等を比較し、通常の研究室単位で実装可能な、費用対効果を最適化した高速マッピングシステムの構築を目指す。

Causes of Carryover

本年度は遺伝資源に由来する分離集団ならびに、突然変異系統と正常系統との交雑に由来する分離集団について、10以上の組み合わせを供試した。各集団あたり100-200程度の個体数を有していることから全体として1000以上の個体の栽培が必要になった。大多数の個体の栽培には圃場を用いる予定であったが、2018年度の梅雨明け以降の干ばつにより、7月上旬の九州北部豪雨以降、8月の中旬までの1か月程度、降雨がほとんど認められない気象条件に見舞われた。その結果、分離集団の多くで発芽不良の個体が多発し、十分な個体数を得ることができない場合があった。本来の計画では、本課題の2年次において、次世代シークエンス解析を集中的に実施し、予算の多くを投入する予定であったが、材料の不足によって十分な解析の実施ができなかったために予算の繰り越しを生む結果となった。材料不足になった集団については、再度、集団の育成を行い、3年次に次世代シークエンス解析を実施する予定でいる。