2019 Fiscal Year Research-status Report

試験管内実験系を利用したポティウイルス増殖機構の解明

Research Project

Project/Area Number	17K07670
Research Institution	Rakuno Gakuen University
Principal Investigator	薦田優香酪農学園大学, 農食環境学群, 准教授 (90716482)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	中原健二北海道大学, 農学研究院, 講師 (90315606)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2021-03-31
Keywords	ポティウイルス / 劣性抵抗性 / プロトプラスト
Outline of Annual Research Achievements	昨年度から行っていた、cyv1劣性抵抗性エンドウを用いた一細胞レベルでのクローバ葉脈黄化ウイルス増殖試験については、ルシフェラーゼ遺伝子を挿入したウイルスを用いて得られたデータを検証するため、さらなる解析を行った。昨年度行ったルシフェラーゼ活性解析では、一細胞レベルでcyv1劣性抵抗性がウイルスの蓄積量に影響しないことが示唆されていた。そこで、クローバ葉脈黄化ウイルスを感染させたエンドウプロトプラストからRNAを抽出し、qPCR解析を行うことで、cyv1抵抗性遺伝子のウイルスゲノムRNA量への影響を検証した。その結果、cyv1劣性抵抗性は、一細胞レベルでのウイルス蓄積に大きく影響しないことが示唆された。この結果は、昨年度のルシフェラーゼ活性測定解析で得られた結果を支持するものであった。本研究成果を論文にまとめ発表した。昨年度に引き続き、ダイズのプロトプラスト化およびトランスフェクション実験の条件検討を行った。ダイズ液体培養細胞からのプロトプラストの単離は、エンドウ葉肉プロトプラスト化で用いる酵素組成にペクトリア－ぜを追加することで、かなり効率的に行うことが可能となった。一方、プロトプラストトランスフェクションは、効率を上げることが難しく、現在も条件を検討中である。ダイズの葉からの葉肉プロトプラスト単離も試みた。ダイズ培養細胞からのプロトプラスト単離と同じ酵素組成では単離の効率が悪いため、現在効率を上げる酵素組成の条件を探っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason エンドウプロトプラストを用いた一細胞レベルでの研究において、劣勢抵抗性遺伝子cyv1とクローバ葉脈黄化ウイルスとの関係の一端を明らかにできた。
Strategy for Future Research Activity	ダイズのプロトプラストトランスフェクション実験を確立することを計画している。
Causes of Carryover	エンドウ葉肉プロトプラストを用いた研究成果をまとめることを優先し、ダイズの培養細胞を用いた実験が、本年度後回しになったため、次年度使用額が生じた。今後、ダイズを用いた実験系の構築を目指した研究等に使用する計画である。