2017 Fiscal Year Research-status Report
Molecular mechanism of rice blast resistance acquisition by SnRK1 involved in plant nutrition metabolism
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17K07678
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| Research Institution | National Agriculture and Food Research Organization |
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Principal Investigator |
林 長生 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 再雇用職員 (90391557)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井上 晴彦 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 主任研究員 (10435612)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | いもち病 / 圃場抵抗性遺伝子 / SnRK1 / 組織局在性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
陸稲品種の「戦捷」に由来するpi21遺伝子は、イネの葉において菌系特異性が無く安定した抵抗性を付与する。単離されたpi21は、特徴的なドメインは持たない機能未知のタンパク質であり、抵抗性pi21は罹病性Pi21の特定の二ヶ所の配列がin frameに欠失することによって生じていた。
Yeast two-hybrid法(Y2H)を用いて、pi21と相互作用する因子の単離を試みたところ、植物の栄養状態や糖の転流に重要な役割を果たすタンパク質リン酸化酵素であるSnRK1を構成するpi21相互作用因子として同定した。pi21を持つイネにおいてSnRK1αあるいはSnRK1βの遺伝子発現を抑制すると、どちらの発現抑制系統でもpi21に依存したいもち病抵抗性が著しく低下した。このことから、上記二つの因子はpi21抵抗性基盤遺伝子として、重要な役割を果たすと考えられている。
植物におけるSnRK1の多数の機能の中から、病原菌への潜在的な防御応答を推測すると、(i) 糖代謝、(ii) 細胞壁合成、(iii) 栄養転流等への関与が考えられる。具体的には、pi21品種ではSnRK1の機能が賦活化し、維管束等において糖代謝や栄養転流を抑制することによるいもち病菌増殖の抑制、及び細胞壁強化によるいもち病菌の侵入阻害等を想定している。
本研究では、pi21またはPi21、および、相互作用因子の機能を比較解析することにより、抵抗性を獲得するに至った本質を明らかにする。さらにこれらの解析を通じて、菌系特異性が無く安定であるpi21抵抗性の背後にある分子基盤を解き明かすことを目的とする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
pi21-SnRK1およびPi21-SnRK1複合体の分子レベルでの差異の解析
キナーゼタンパク質は通常、自己リン酸化能を有することが多い。そこで、pi21及びPi21によって、SnRK1αの自己リン酸化能が変化するか調べる。具体的には、pi21及びPi21を共存させることで、大腸菌で発現させたSnRK1αタンパク質の自己リン酸化能が変化するかどうかを調べる。現在、GSTタンパク質を融合させたタンパク質を、大腸菌で発現させようとしている。しかしながら、融合タンパク質が発現しない状態であり、条件検討が必要である。また、大腸菌での融合タンパク質発現がうまくいかない場合には、計画通り小麦胚芽抽出液を用いて同様の実験を行う。
pi21およびその抵抗性に関わるSnRK１群の時空間的発現の変動を解析
pi21イネにいもち病を接種する際に観察される特徴的な針状型病斑は、pi21の抵抗性に関わる相互作用因子の遺伝子発現の組織局在性と関係があると考えられる。これを検証するために、いもち病病斑周辺の、pi21相互作用因子の遺伝子発現をレポーター遺伝子を用いることで可視化し、病斑の形成のメカニズムを解析する。具体的には、SnRK1αやSnRK1β等の相互作用因子の上流2kbpのプロモーター領域を、pi21ゲノム中よりPCR法によって単離した。このPCR断片を、レポーター遺伝子であるGUS遺伝子を含む、pSMAベクターにIn-fusion法（タカラバイオ）によって導入した。これを、pi21品種由来またはPi21由来のイネカルスへ、アグロバクテリウム法により遺伝子導入した。これらカルスを、選抜培地、植物再生培地を経て、現在、形質転換イネが育成しているところである。
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| Strategy for Future Research Activity |
pi21-SnRK1およびPi21-SnRK1複合体の分子レベルでの差異の解析
SnRK1αのGST融合タンパク質を大腸菌で発現させて、SnRK1タンパク質が自己リン酸化能を有するか検証するとともに、リン酸化の相手となるPi21やpi21がリン酸化されるかどうかを調べる。リン酸化が見られる場合には、Pi21とpi21でリン酸化の程度に差があるか、またリン酸化されるアミノ酸残基に差があるかどうかを解析する。また、プロトプラストによる一過的発現系を使って、同様の実験が再現できるかも調べる。Pi21とpi21でリン酸化されるアミノ酸残基に差がある場合には、そのアミノ酸残基を変異させた変異型pi21を作製し、次年度以降組換え体イネを作製し、いもち病抵抗性検定を行う。
pi21およびその抵抗性に関わるSnRK１群の時空間的発現の変動を解析
pi21イネにいもち病を接種する際に観察される特徴的な針状型病斑は、pi21の抵抗性に関わるSnRK1群の遺伝子発現の組織局在性と関係があると考えられる。現在、SnRK1群のプロモーターGUS形質転換植物を育成しているが、これらの種子が取れ次第、いもち病接種による発現の組織局在性の解析を実施する。いもち病を接種し、形質転換植物をGUSの基質であるX-gluc液に浸漬し、温度をかけることによって染色を行う。
pi21とPi21遺伝子はいもち病接種によってその発現が低下することが、以前に報告されている。しかし、そのタンパク質の挙動は明らかにされていない。そこで、pi21およびPi21の共通配列を用いて抗体を外注している。これが完成したら、pi21またはPi21の植物体を用いて、タンパク質が検出できるか否かを検証する。
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| Causes of Carryover |
pi21-SnRK1およびPi21-SnRK1複合体の分子レベルでの差異の解析において、プロテインインヒビターの種類の選定が遅れ、発注出来なかった。次年度に購入予定である。SnRK1αのGST融合タンパク質を大腸菌で発現させて、SnRK1タンパク質が自己リン酸化能を有するか検証するとともに、リン酸化の相手となるPi21やpi21がリン酸化されるかどうかを調べる。
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