2017 Fiscal Year Research-status Report
Oxidation of various compounds by quinoproteins with broad substrate specificities
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17K07722
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
藥師 寿治 山口大学, 大学院創成科学研究科, 准教授 (30324388)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
片岡 尚也 山口大学, 大学院創成科学研究科, 助教 (50713509)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 酢酸菌 / 発酵 / 応用微生物 / 酵素 / バイオテクノロジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
酢酸菌は，他の微生物にはあまり見られない酸化的物質変換能を持ち，古くから酢酸発酵やビタミンＣ生産におけるソルボース発酵などに用いられてきた。これらは，細胞質膜の外側に存在する，ピロロキノリンキノン（PQQ）を補欠分子族とするキノプロテイン，フラビン（FAD）を補欠分子族とするフラボプロテイン，モリブドプテリン（MCD）を補欠分子族とするモリブドプロテイン脱水素酵素による酸化反応である。ゲノム解析の進展に伴って，基質が明らかでない脱水素酵素候補遺伝子が多く報告されている。加えて最近，キノプロテイン脱水素酵素の基質特異性が比較的厳しくなく，寛容な（ここでは「ゆるい」と表現）ことがわかってきた。すなわち，基質未知の「オーファン」キノプロテイン脱水素酵素だけでなく，これまでに知られている酵素についても，一つ一つ発現系を作りその基質特性を調べることによって，「ゆるい」基質特異性を活用する新しい酸化反応系を見つけることができる可能性がある。この目的のために，可能な限り脱水素酵素を持たない酢酸菌変異株を構築する。私たちは，耐熱性を示すGluconobacter frateurii CHM43株を，有望な物質生産株と位置づけており，この菌株を基に多重遺伝子欠損株を構築する。ここで構築する変異株を宿主とすることで，発現させるキノプロテインの活性を特異的に検出する。さらに，その反応産物の構造を決定することによって，当該酵素による反応機構を考察する。最終的には，新しい酸化反応を用いる効率の良い酸化的物質変換系を構築する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
耐熱性Gluconobacter frateurii CHM43株の，キノプロテイン・グリセロール脱水素酵素（GLDH）複合体をコードするsldBA遺伝子を破壊した変異株を用いて，GLDHの基質特異性を再検討した。その結果，GLDHがL-リボースを基質とすることを見いだした。また，反応産物の構造を解析することでそれがL-リボン酸であることを明らかにした。sldBA遺伝子に加えて，キノプロテイン・アルコール脱水素酵素（ADH）の脱水素酵素サブユニットとチトクロムサブユニットをコードするadhAB遺伝子を破壊した二重破壊株を宿主として，広宿主域ベクターを用いてsldBA遺伝子の過剰発現を行った。このGLDH高発現株からGLDHを精製し，精製酵素を用いた物質酸化を行った。
多重遺伝子欠損株の構築は，現在，sldBA遺伝子とadhAB遺伝子に加えて，フラボプロテイン・グルコン酸脱水素酵素（GADH）複合体をコードするgndFGH遺伝子の３遺伝子について完成した。ADHに関して詳細な解析を行うために，３つのサブユニットの内，チトクロムサブユニット遺伝子だけを破壊した株を構築した。ADHの小サブユニット遺伝子の破壊プラスミドを構築し，破壊株の構築を試みたが，現在までに完成には至らなかった。同様に，キノプロテイン・グルコース脱水素酵素も破壊用プラスミドの構築は完成したものの，破壊株の取得には至らなかった。以上のように，特定の酵素に関する機能解析は，技術的な面も含めてある程度成果を得ることができたが，多重遺伝子欠損株の構築については難航しているところもある。理由としては技術的な問題を考えている。今後の展開も含めて，「概ね順調」と評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
大きな問題として感じているのは，当初の想定以上に破壊株の作製に難航している点である。これは，本研究課題の全般に関わる問題で，速やかに解決する必要があると感じている。技術的なことではあるが，本菌への遺伝子導入法には電気穿孔法と呼ばれる人工的な手法を用いている。この方法自身はこれまでに系統的に検討したことは無く，他のバクテリアで用いられた例を参考にした方法にすぎない。すなわち，一つ目の検討課題として，系統的な遺伝子導入法の最適化を計画している。また，第二の検討課題として以下を考えている。
この研究では，遺伝子の供給源として大腸菌を用いてDNAの増幅を行っている。大腸菌で増幅されたDNAには，大腸菌の目印（メチル化）が入っており，Gluconobacterのそれとは区別される可能性がある。よって，Gluconobacter細胞内では大腸菌由来のDNAは異分子と見なされ，分解のターゲットとなることが懸念される。この分解が，遺伝子導入の妨げとなっていると考えている。これを回避するために，GluconobacterのDNAメチル化酵素を発現する大腸菌内で遺伝子破壊用プラスミドを増幅させることを計画している。これにより，分解を逃れたDNAがGluconobacterに効率よく導入されることを期待している。
最後に，特定のキノプロテイン脱水素酵素の研究も計画しており，GDHとADHについて，基質特異性を中心とした機能解析を進める。
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| Causes of Carryover |
当該年度に予算を使用しなかった理由は，（１）破壊株の構築が難航したため，部分的に研究計画が遅延し，当初購入を計画していた物品を購入しなかった，（２）上記の理由により，当初計画していた謝金を使用しなかった，この２つである。次年度には当該年度に進まなかった破壊株の構築とそれらを用いた解析を進めるため，（１）と（２）で使用しなかった予算を使用し，研究を進める計画である。
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Research Products
(14 results)
