2018 Fiscal Year Research-status Report
Oxidation of various compounds by quinoproteins with broad substrate specificities
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17K07722
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
藥師 寿治 山口大学, 大学院創成科学研究科, 教授 (30324388)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
片岡 尚也 山口大学, 大学院創成科学研究科, 助教 (50713509)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 酢酸菌 / 発酵 / 応用微生物 / 酵素 / バイオテクノロジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
酢酸菌は，他の微生物にはあまり見られない酸化的物質変換能を持ち，古くから酢酸発酵やビタミンＣ生産におけるソルボース発酵などに用いられてきた。これらは，細胞質膜の外側に存在する，ピロロキノリンキノン（PQQ）を補欠分子族とするキノプロテイン，フラビン（FAD）を補欠分子族とするフラボプロテイン，モリブドプテリン（MCD）を補欠分子族とするモリブドプロテイン脱水素酵素による酸化反応である。本研究では，本菌のキノプロテイン脱水素酵素が低い基質特異性（ここでは，以下「ゆるい」と表現）を持つことを利用して，新しい物質酸化系の構築を目的とした。当該年度は，グルコース脱水素酵素（GDH）を用いたラクトースからのラクトビオン酸生産を試みた。グルコースと比べると，GDHはラクトースに対して1%程度の酸化活性しか示さない。そこで，GDHを過剰発現する菌株を作製し，この休止菌体を用いて物質変換反応を行った。ラクトビオン酸生産能の優れた菌株と比べて，約5倍の高速度で行うことができた。100 mMのラクトースから，24時間で65 mMのラクトビオン酸を生産した。また，基質との親和性を表すKM値の測定を試みたところ，測定不可能なほど親和性が低い事がわかった。このように，酵素の高発現によって物質変換速度を上げることで，本来反応性が悪い基質を効率良く利用して物質生産できることを示した。
加えて，グルコノバクター属酢酸菌を用いて，形質転換効率を上昇させる試みを行った。酢酸菌で行われていると考えられるDNAのメチル化を，大腸菌の中で再現させることで，その大腸菌から抽出されるDNAが高い形質転換効率を示すと考えた。ゲノム情報を基に，制限酵素遺伝子を近傍に持つメチル化酵素遺伝子を３つ選び検討したところ，一つだけ高い形質転換効率を示すものを見いだした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
グルコノバクター属酢酸菌のGDHの基質特異性を再検討し，特に二糖であるラクトースとの反応性を詳細に検討した。結果として，新しい酸化的物質酸化系を提案することができた。それと同時に，親和性が低いことによると考えられる，低い物質変換効率という問題も新しい課題として見えてきた。
一方，形質転換の検討については，効率上昇の兆しが見えてきたと評価する。今後，いくつかの検討を重ねることにより，安定な実験系が構築できると期待している。今後の展開も含めて，「概ね順調」と評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
既知のキノプロテイン脱水素の解析については，GDHの解析を進めるとともに，アルコール脱水素酵素（ADH）の解析も開始する。ADHも高濃度の時にのみグリセロールを酸化することができるといった特徴を持ち，「ゆるい」基質特異性を示す。ADHは結晶構造解析も進めているので，基質結合に直接関わるアミノ酸残基の同定など，より詳細な検討ができると期待している。
破壊株の作製については難航しているが，メチル化酵素遺伝子の利用により，改良の兆しが見えてきた。まずは再現性の確認を行い，実験系の安定性を見きわめる。効果を示したメチル化酵素遺伝子を持つプラスミドは，特異性タンパク質をコードする遺伝子も同時に持たせているため，この特異性タンパク質の必要性も検討する。
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| Causes of Carryover |
遺伝子破壊株の構築が実施できなかったため，部分的に研究計画が遅延し，購入を計画していた消耗品を購入しなかった。また，同じ経緯により，計画していた謝金を使用しなかった。この二点が大きな理由として挙げられる。次年度には，遺伝子破壊株を構築するため，使用しなかった予算を消耗品の購入と謝金として使用し，研究を進める計画である。
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