2017 Fiscal Year Research-status Report
Puberty control of Japanese pufferfish (Takifugu rubripes) by intraabdominal injection of coconut oil
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17K07911
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
山口 明彦 九州大学, 農学研究院, 助教 (10332842)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 中鎖脂肪酸 / フィードバック / 植物性油脂 / 内分泌攪乱 / アンドロゲン / エストロゲン / 黄体形成ホルモン / 下垂体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
中・大型養殖対象魚は初回成熟までに数年を要するため（クロマグロ５年、シロチョウザメ10年等）、生産効率を高める早期成熟技術の開発が求められている。初回成熟（精子形成、卵黄形成）の開始年齢は肥満度（脂肪蓄積度）との相関が知られる。トラフグは年1回産卵型の魚種であり、飼育実験環境下では雌雄共に3年目で初回成熟を迎えるが、一部の雄では2年目で成熟する個体も現れる。晩秋から厳冬期にかけて生殖腺は急速に発達し、雌雄共に血中テストステロン（T）濃度の著しい上昇をともない黄体形成ホルモン（LH）の大量合成と放出によって最終成熟（排卵・排精）が起こる。トラフグ下垂体ではT→エストロゲン（E2）への変換を行うチトクロームP450酵素である脳型アロマターゼ（CYP19a1b）がLH細胞に高い活性で存在し、これら２つの蛋白質の共役が成熟に重要と予想されたので、下垂体へのTフィードバック回路の活性化機構を調査した。Tは脂質代謝（エネルギー産生）と密接に関係し、ヒトではTの低下は内臓脂肪肥満症の原因としても知られる。しかし魚類では生殖腺以外のT産生組織やその代謝調節機構に関して不明な点が多い。中鎖脂肪酸（炭素を結ぶ鎖の数が6-12個の飽和脂肪酸）はココナッツ油に代表される植物性油脂に多く含まれエネルギー効率が良くTの増加を促す作用があり、魚類でもT代謝経路の調節に利用できると考えた。本年度はココナッツオイルを代表とする植物性脂肪酸およびサプリメントとして市販されている中鎖脂肪酸油を未成熟トラフグ（♀）腹腔内へ投与後、Tフィードバック回路への影響を検証した。また生殖腺切除個体を準備し同様に解析した結果、性別、年齢や個体差はあるものの、ラウリン酸の含量が多いココナッツ油およびパーム核油で血中T濃度の増加する個体が出現し、それにともない下垂体でのアロマターゼ・LH細胞の発現領域の増加が確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
I：未成熟期（♀ 20ヵ月齢）トラフグに植物性油脂を腹腔内へ投与し2ヵ月間飼育した。（鉱物油）ミネラルオイル、（植物油）ヒマワリ油、パーム油、パーム核油、ココナッツ油、および無処理の計６区（N=3）でTフィードバック回路の活性化を検証したココナッツ油およびパーム核油でT濃度の上昇を確認したが、現在までに卵黄蓄積は起らず早期成熟誘導までには至っていない。中鎖脂肪酸含量の多い植物油は過剰に生体投与した場合、ホルモンバランスを崩す内分泌攪乱作用を持つことが示唆された。この結果は、魚類の生体内では中鎖脂肪酸がホルモン合成のメッセンジャーとしての役割を担っていることを示唆している。現在0歳魚（雌雄）からのココナッツ油およびMCTオイル投与群を継続して飼育しており1歳魚での早期成熟促進効果について解析を行っている。
II 生殖腺切除個体（未成熟期♂/♀ 20-23ヵ月齢、10-12ヵ月齢）を準備後、ココナッツ油を投与しTフィードバック機構に関する生殖腺の役割について解析した。各個体でELISA法による血清T濃度の測定とISHとIHCを併用した組織化学法を用いて、各種下垂体ホルモン遺伝子(gh, cga, tsh-b, fsh-b, lh-b, cyp19a1b)のmRNA分布、共焦点顕微鏡を用いた蛍光強度測定による蛋白質（CYP19, LH）の発現量の解析を行い、Tフィードバック回路の活性化を評価した結果、同年齢・同重量の個体でも雌雄でその反応が異なることが明らかになった。20-23ヶ月齢の卵巣切除個体ではココナッツ油の投与はTの上昇およびLHの合成はなかったが、精巣切除個体ではTの上昇およびLHの合成が確認できた。以上の結果よりココナッツ油による精巣以外の組織でTの合成誘導が示された。一方雌では卵巣がT合成の主要組織であり、成熟開始に重要な役割を担っていると考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在までの解析で、他の処理群に比べココナッツ油投与群では血清T量と下垂体CYP19発現細胞面積との間に正の相関がみられている。また精巣切除個体（未成熟）ではココナッツ油投与によりLHの発現が確認できた。これらの結果はココナッツ油に含まれる脂肪酸が精巣以外の組織で下垂体へのTフィードバック回路を活性化させたことを示唆する。しかしその分子機構は未解明である。T→DHT活性をもつ5αレダクターゼ（５AR）の制御がT増加の要因と考えられる。平成30年度は哺乳動物培養細胞へトランスフェクションを行いココナッツ油に含まれる中鎖脂肪酸（ラウリン酸・ミリスチン酸・カプリン酸・カプリル酸等）のトラフグ5αレダクターゼに対する効果を個別に解析する。特に卵巣での５AR活性が雌の早期成熟促進には重要と考えており、５AR遺伝子発現機構について調査を進める。MCTオイルはココナッツ油から中鎖脂肪酸（カプリン酸、カプリル酸）を抽出した油であるがその効能についても解析を行う。ココナッツ油・MCTオイルをトラフグへ月1回ほどの割合で投与を続け、Tフィードバック機構および生殖腺の成熟促進効果をついて調査を行う。
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| Causes of Carryover |
平成29年度にウサギポリクローナル抗体の外注を行う必要が生じ、当年度の支払い請求額では足りないことから30年度、31年度からそれぞれ前倒しとして１0万円（計20万円）を請求した。その結果年度内に使用できなかった35,607円の繰越金が生じた。この繰越金は30年度の物品費として使用する予定である。
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