2018 Fiscal Year Research-status Report
頭足類酸素運搬蛋白質ヘモシアニンの会合体形成過程における酸素結合協同性の変化
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17K07942
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
加藤 早苗 鹿児島大学, 農水産獣医学域水産学系, 准教授 (80291061)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 酸素運搬 / ヘモシアニン / アロステリック効果 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
海洋軟体動物ヘモシアニンは血リンパ液に存在する細胞外酸素運搬タンパク質であり、その分子量および分子構造は節足動物ヘモシアニンとは大きく異なる。この分子は最大のタンパク質分子のひとつで、分子量3.5～14 MDa の超巨大会合体であり、頭足類の分子は10 量体、腹足類の分子は20 あるいは30 量体であると報告されている(Markl,J.(2013))。ヘモシアニンはヘモグロビンの様にアロステリック効果を持つと考えられているが(Zhang,Q., et al.(2013))、巨大な会合体の生化学研究は進んでいない。そこで本研究では、軟体動物ヘモシアニンの会合体形成の生理的意義およびアロステリック制御機構の解明をめざし、会合体形成過程におけるアロステリックな会合中間体の同定を研究目的としている。
初年度は、活イカから得たヘモシアニン試料について、10量体と会合体解離物の試料を調製し、超遠心分離による分画を行い、画分中の会合体および解離物の補正を電気泳動上で区別する測定系を構築した。さらに、基本的な酸素結合能測定法を構築した。2年目にあたる本年は、酸素/窒素混合ガスをヘモシアニン試料に曝露したときの、酸素結合型ヘモシアニン由来の紫外/吸光スペクトルを測定し、酸素濃度依存性から酸素結合曲線を作成した。温度やpHを変えて様々な条件での酸素結合曲線を得て、さらにそれら測定データに対してHill式によるコンピュータフィッティングにより、Hill係数と酸素とのKm を算出した。その結果、中性～弱酸性域でのわずかな pH の低下がアロステリック効果の急激な低下を引き起こすことが示唆された。また、この時、会合体構造が変化していることを示すデータを得たため、このpH域でアロステリックな会合中間体が存在することを推察した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
計画では二価カチオンを添加したin vitro 条件下での会合中間体生成を考えていたが、本研究実施にあたり、温度および pH を変えて酸素結合曲線を検討した結果、溶液条件を大きく変えることなく目的の会合中間体を捉えることができた。本研究に最適の測定方法およびデータ解析法の構築にも成功しており、最終年度へ向けて予想以上に親展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
酸素結合能測定した試料の会合体構造に関するデータを収集し、構造と生理機能の関係を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
今年度はサンプリングに関わる旅費、実験動物費が当初予定額より下回った。また、論文投稿料が不要となった。これら今年度未使用額は次年度のサンプリングに関わる旅費、実験動物費、論文投稿料として使用する計画である。
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[Journal Article] Cryo-EM reveals the asymmetric assembly of squid hemocyanin2019
Author(s)
Tanaka, Y., Kato, S., Stabrin, M., Raunser, S., Matsui, T. & Gatsogiannis, C.
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Journal Title
International Union of Crystallography (IUCr)
Volume: 6
Pages: 426-437
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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