2017 Fiscal Year Research-status Report
Biosynthesis mechanisms of fucoidan from algae
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17K07944
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| Research Institution | University of the Ryukyus |
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Principal Investigator |
小西 照子 琉球大学, 農学部, 教授 (30433098)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 海藻多糖 / 生合成 / フコイダン / GDP-フコース / オキナワモズク |
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| Outline of Annual Research Achievements |
H29年度の計画では[14C]グルコース、[14C]マンノース、 または[14C]フコースのフコイダンへの取込み実験を行う予定であったが、試験に用いるオキナワモズクの培養株が無菌ではなく、多くのバクテリアが付着していることが判明した。実験におけるバクテリアの影響を排除するためには、無菌株が必要であり、現在は無菌株の作成を行っている。取り込み実験については無菌株を得てから行う予定である。そのため、H29年度はH30年度以降の計画を前倒しし、GDP-フコースの合成に関与する酵素であるGDP-マンノース-4,6-デヒドラターゼ（GM4,6D）およびGDP-フコースシンターゼ(GFS)、フコキナーゼ/GDP-フコースピロフォスフォリラーゼ(FKGP)の3種類の酵素について研究を行った。オキナワモズク藻体からRNAを抽出しcDNAの調製後RT-PCR法によりこれらの遺伝子を単離した。得られた遺伝子はGM4,6Dが0.8 kb、GFSが1.0 kb、FKGPが3.4kbであった。これら遺伝子をそれぞれ大腸菌用発現ベクターpET24aに組込み、大腸菌にて組換え酵素を作成した。得られた組換え酵素をHisカラムにて精製後、酵素活性試験を行った。その結果、GM4,6Dにおいては酵素活性が確認できたものの、GFSおよびFKGPについては酵素活性が確認できなかった。また、フコイダンの生合成試験（次々年度実施予定）に必須のフコイダンオリゴ糖は市販されていないため、自ら調製する必要がある。そこで、オキナワモズク藻体からフコイダンを抽出・精製し、酸による部分加水分解を行った。加水分解物をゲルろ過クロマトグラフィーに供し、オリゴ糖を分画・精製した。本条件にて部分加水分解を行った結果、種として８糖に相当する画分が得られた。現在、８糖に相当するオリゴ糖を調製し、構造解析を行っているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
オキナワモズクに多くのバクテリアの付着が確認され、オキナワモズクの無菌株の獲得に時間を要することとなった。そのため、H29年度に予定していた糖の取り込み実験についてはH30年度以降に検討することとした。オキナワモズクは３月～５月に収穫時期のピークを迎え、単子嚢を有する藻体を獲得できる機会は一年にこの時期の一度しかないことから、この時期は無菌株の獲得に時間を割くこととし、無菌株が得られて以降に取り込み実験を行う予定である。当初の計画ではオキナワモズクの無菌株の培養は組み込まれていなかったものの、H30年度の計画として新たに追加する。GDP-フコース合成に関与する酵素については、既にオキナワモズクから遺伝子を単離しており、大腸菌用発現ベクターの構築までを終えた。酵素活性が検出できるかが次の課題であるが、今のところGDP-フコースシンターゼ(GFS)、フコキナーゼ/GDP-フコースピロフォスフォリラーゼ(FKGP)の２種については組換えタンパク質の発現は成功しているものの酵素活性が検出出来ない状況である。そのため、発現系を変えるなど工夫し、引き続き組換え酵素の活性について検討を行う。
また、フコイダンオリゴ糖の調製法についてはH29年度にある程度の進捗が見られた。フコイダンを酸で処理することで一定の決まったオリゴ糖を得ることに成功している。得られたオリゴ糖の精製まで済ませており、H30年度はそのオリゴ糖の構造を決定する予定である。これによりH30年度中にはオキナワモズク由来のフコイダンオリゴ糖の調製方法を確立出来る見込みである。得られたフコイダンオリゴ糖を用いてフコイダンの生合成試験を検討する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
オキナワモズクは造胞体とよばれる藻体に成長すると単子嚢を付け、単子嚢から次世代のための遊走子を放出する。H30年度の予定として、３月～５月にかけて単子嚢を有するオキナワモズクを採取し、遊走子を回収して無菌株の盤状体を獲得する。オキナワモズクの無菌株盤状体が得られた後は、その無菌株を用いて[14C]グルコース、[14C]マンノース、 または[14C]フコースのフコイダンへの取込み実験を行う予定である。
また、GDP-フコースの合成に関与する酵素であるGDP-マンノース-4,6-デヒドラターゼ（GM4,6D）およびGDP-フコースシンターゼ(GFS)、フコキナーゼ/GDP-フコースピロフォスフォリラーゼ(FKGP)のうち、酵素活性が得られなかったFKGPおよびGFSについてはタンパク質の発現システムを変更する。まず大腸菌用のpET32aで発現ベクターを構築し、分子シャペロンであるpGRO 7と共発現させ、組換え酵素を調製する。この方法においても活性がつかめない場合は宿主を大腸菌ではなく酵母に変更するなど、大腸菌とは異なる発現系を用いて組換え酵素を作成し、酵素活性試験を行う。
さらにフコイダン合成酵素の活性試験のためにフコイダンオリゴ糖を調製する。現在フコイダンオリゴ糖を調製中であるが、本方法によりフコイダンオリゴ糖の調製法を確立出来る見込みである。ネイティブ多糖および脱硫酸化多糖のフコイダンオリゴ糖を調製し、オリゴ糖が必要量調製できたのちに、オキナワモズクから酵素を調製しGDP-フコースおよびフコイダンオリゴ糖を用いて活性試験を行う。フコイダンオリゴ糖の調製法ついてはH30年度中に確立出来る見込みである。
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Research Products
(1 results)
