2017 Fiscal Year Research-status Report
吸血コウモリ由来狂犬病の感染拡大阻止を目的とした進化疫学研究
| Project/Area Number |
17K08086
|
|---|
| Research Institution | Nihon University |
|---|
Principal Investigator |
酒井 健夫 日本大学, 生物資源科学部, 名誉教授 (50147667)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
伊藤 琢也 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (20307820)
鈴木 由紀 日本大学, 生物資源科学部, 講師 (30712492)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | 吸血コウモリ / 狂犬病ウイルス / 分子疫学 / 次世代シーケンサー |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
研究代表者らは、これまでブラジルにおいて吸血コウモリが媒介する狂犬病ウイルス（RABV）のゲノム遺伝子断片を解析し、吸血コウモリ由来RABVの分子疫学を行ってきた。その結果、吸血コウモリ由来RABVは、吸血コウモリの生態を反映した地域毎の遺伝的多様性が存在することを明らかにした。しかし、吸血コウモリ由来RABVを集団として分子疫学解析に用いる場合には、お互いに塩基相同性が非常に高いため、塩基置換情報が乏しく、遺伝子グループ間の系統関係を精度高く解析することが困難であった。そこで本研究は次世代シーケンサー（NGS）を活用し、吸血コウモリ由来RABVの全長ゲノム配列を決定することによって、吸血コウモリ由来RABVの詳細な疫学を明らかにすることを目的とした。
材料に用いたRABVのRNAゲノムは、長期保存によって断片化が進んでいたので、本研究は、RABVの全長配列をカバーできる複数のプライマーセットを設計し、マルチプレックスRT-PCRを行い、増幅産物であるアンプリコンのライブラリ調整を行い、それらをNGSシーケンスに供した。吸血コウモリ由来RABV8検体をNGS解析で配列決定した。一部NGSで塩基配列決定ができなかった領域は、サンガー法によって塩基配列を決定した。その結果、RABVのほぼ全長領域にあたる11.8Kbの塩基配列を決定することができた。これら塩基配列を用いて分子系統樹を作製したところ、N遺伝子やG遺伝子など、従来の分子疫学研究で標的とされてきたRABVの各遺伝子で作製した分子系統樹よりも非常に信頼度が高い分子系統樹を作製することができた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究でNGS解析の材料とするRABVのウイルスゲノムRNA試料には、罹患動物の脳組織からウイルス核酸を回収する際に混入する宿主由来のRNA核酸が大量に含まれており、それらがウイルスゲノムのNGS解析の妨げとなっていた。また、当研究室で保管しているRABVのRNAは断片化が生じていて、長いゲノム領域を直接増幅することが困難であった。そこで上記2つの問題を解決するために、本研究ではRABVの全長配列をカバーする複数のプライマーセットを設計し、それらを用いたマルチプレックスRT-PCRによってほぼRABVゲノム全長に相当する領域を増幅できる手法を確立できた。
上記の確立された手法を用いて、吸血コウモリ由来RABV 8検体を材料にしてマルチプレックスRT-PCRを行い、増幅されたアンプリコンの濃度調整を行ってライブラリー試料を調製した。NGS解析のために濃度を最適化したライブラリーの品質チェックを行った後、MiSeqによって8検体の吸血コウモリ由来RABVのほぼ全長をカバーする領域のゲノム配列を得た。
一方でNGS解析で配列解読が困難な領域が一部存在した。特にRABVのGおよびL遺伝子領域の遺伝子間領域、また3’および5’末端領域は解読困難な領域が多く見られた。それら一部の領域については、従来法であるサンガーシーケンスによって別途配列解読を行った。
以上のように、保管材料の吸血コウモリ由来RABVのゲノム試料からマルチプレックスRT-PCR、NGS解析、およびサンガーシーケンスを組み合わせることによって、ほぼ全長の吸血コウモリ由来RABVゲノム配列を解読する一連の方法論を確立することができた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
初年度に、吸血コウモリ由来RABVの全長ゲノム配列解読のための一連の方法論が確立できたので、今後はその方法の精度をより高めると同時に、解析する検体数を増やすことにより、吸血コウモリ由来およびその近縁種のコウモリ由来RABVのより詳細でより正確な分子系統樹作製が見込まれる。その結果、吸血コウモリRABVの起源を辿ることができるような分子疫学解析が行えることが期待される。
すなわち、全長配列を決定した吸血コウモリ由来RABVのシークエンスデータと、吸血コウモリRABVと共通祖先を持つことが予想されるメキシコオヒキコウモリ（T. brasiliensis）分離RABVおよび中南米の他の地域で分離された吸血コウモリ由来RABVの既存登録配列データを用いて分子系統樹を作製し、RABV間の進化距離および分岐年代を推定する。分子系統樹の樹形から推定されるRABVの拡散経路を基に、ウイルス間の進化距離と分離地域の地理的距離の相関性を解析し、T. brasiliensisから吸血コウモリに感染したRABVがいつ、どこからブラジルの吸血コウモリに伝播し、その後、どのような経路でブラジルの吸血コウモリの間に感染が拡大していったのか明らかにする。また、そこに分岐年代の情報を加えることにより、異なる地域間におけるRABVの感染拡大速度を推定し、拡大速度が早い地域、遅い地域にはどのような地形が影響するのか解明する。また、ヨーロッパからのウシの導入によって吸血コウモリ由来ウシ狂犬病が急速に拡大した可能性があるので、RABVの集団サイズの変化を推定する。すなわち、コウモリ由来RABVの全ゲノム配列データセットおよび分離動物の履歴や位置情報を材料として、BEASTによる分子進化解析および集団遺伝解析によって、進化速度および分岐年代の推定、並びに過去におけるウイルスの集団サイズの変動を推定する。
|
Research Products
(2 results)
