2017 Fiscal Year Research-status Report
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17K08104
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
山口 剛士 鳥取大学, 農学部, 教授 (70210367)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 鶏病 / ワクモ / Dermanyssus / ワクチン / 薬剤抵抗性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ワクモの有機リン系薬剤抵抗性遺伝子診断技術確立のため、標的分子であるコリンエステラーゼコード領域の全塩基配列を明らかにし、これら薬剤に抵抗性および感受性ワクモ集団に特異的な塩基配列を明らかにした。ピレスロイド系薬剤については、標的分子のNaチャネル遺伝子に認められた抵抗性および感受性各ワクモ特異的塩基配列のコンベンショナルおよびリアルタイムPCR法による検出を試みた。現時点で両者を特異的に鑑別可能な検出技術の確立には至らず、国内ワクモの薬剤抵抗性に関する分子疫学についてはワクモサンプルの収集に留まっている。次に、薬剤代謝に重要な役割を担うGST およびシトクロムP450遺伝子のワクモにおける実態解明のためワクモのRNAseq解析データを検索した。推定アミノ酸配列にGSTおよびP450分子に特徴的な機能ドメインが予測されるGST様およびP450様配列が、それぞれ12および 35認められた。
ワクチン候補分子の探索では、ワクモのRNAseq解析データから血液消化などとの関与が推定される遺伝子を探索、これまでに４つの遺伝子とその全塩基配列を明らかにした。各遺伝子はクローン化し、一部は大腸菌での発現を確認した。また、ワクモの生存に重要な役割を担うと考えられるプロテインジスルフィドイソメラーゼ（PDI）遺伝子をクローン化し大腸菌で発現、発現PDIの機能をin vitroで確認後、免疫血清を作出した。PDIのワクチンとしての可能性を検討するため免疫血清による活性阻害試験を実施したが、抗血清にPDI阻害活性は認められなかった。この他にもワクモ乳剤から得たセリンプロテアーゼ画分の鶏への免疫試験を実施したが、ワクチン効果を示唆する成績は得られていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ワクモにおける薬剤抵抗性の遺伝子診断技術確立では、ピレスロイド系薬剤の標的分子であるNaチャネル遺伝子を標的に、抵抗性および感受性各ワクモ特異的に認められる塩基配列の検出を試みた。しかし、当初期待したいずれの方法でも特異的検出に至らなかった。Naチャネル遺伝子は、抵抗性および感受性特異的塩基の周辺にワクモ集団によっては抵抗生と無関係な変異が散在しており、このことが特異的配列の検出を困難にする要因の一つと考えられた。有機リン系薬剤の標的であるコリンエステラーゼ遺伝子については全領域の塩基配列を解読し、抵抗性および感受性ワクモに特異的な塩基配列の存在を明らかにした。またワクモの薬剤感受性解明のため実施している薬剤代謝酵素の解明については計画通りに進んでいる。
ワクチン候補分子の探索では、これまでに候補となる４分子を明らかにし、免疫試験に向けた遺伝子のクローン化を終えた。一部は大腸菌での発現を確認したが封入体を形成していたことから免疫試験に至らず、当該分子の可溶化およびリフォールディングに時間を要している。また、ワクチン候補分子のスクリーニングにRNAiによるノックダウンの影響評価を実施する予定で、浸漬法およびマイクロインジェクション法によるノックダウンを試みたが、現時点で有効な手法の確立には至っていない。しかし、RNAiによるワクチン候補分子のスクリーニングは必ずしも必須工程ではないことから、このまま発現抗原の精製と免疫の実施を予定している。
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| Strategy for Future Research Activity |
薬剤抵抗性および感受性の遺伝子診断を確立するため、ピレスロイド系薬剤の標的であるNaチャネル遺伝子については他の方法による検出について検討を進める。また、有機リンおよびカーバメート系薬剤の標的であるコリンエテラーゼ遺伝子に認められた塩基配列多型については、コンベンショナルPCRまたはリアルタイムPCR法による検出を試みた。分子疫学調査の対象とするワクモの収集は継続して行う。
ワクチンについては、これまでに候補として得た４遺伝子の大腸菌発現抗原を精製、鶏への免疫試験を行う。発現タンパク質の大腸菌での封入体形成や十分な発現量が得られない分子については、リフォールディングや宿主変更を検討する。発現量の少ない組換え体については、大腸菌と節足動物のワクモでコドンの出現頻度が異なっており、このことが発現量に影響している可能性もあるため、大腸菌に適したコドンに変換した遺伝子の合成についても検討する。ワクチン候補となる上記遺伝子については、ワクモ吸血における役割の一端を明らかにするため、吸血による遺伝子発現量の変化についても合わせて検討する。また、ワクモ内部における各分子の分布状況を明らかにするため、各分子に対する抗血清を作出し、免疫染色による解明を試みる。
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| Causes of Carryover |
ワクチン候補分子をコードする遺伝子のクローニングおよび発現までは計画通りに進んだ。しかし発現産物の封入体形成や発現量の問題により発現産物の精製が遅れ、鶏を用いた免疫試験の実施には至らなかった。また、各種薬剤抵抗性を決定する遺伝子の多型検出に必要となる技術の確立に至らず分子疫学的解析に着手することができなかった。これらの理由により次年度使用額の発生に至った。次年度は、各ワクチン候補分子の組換え蛋白質としての発現・精製を推進し、ワクチン効果の評価を実施する予定である。発現用の宿主として使用している大腸菌と節足動物のワクモでは同じコドンでもその使用頻度に差があることが推察され、このことが発現量等に影響している可能性もある。そこで各遺伝子について大腸菌で稀なコドンがあった場合には、DNA合成により大腸菌での発現に適したコドンへの修正やバキュロウイルスなど他の宿主を用いた発現についても検討する予定である。薬剤抵抗性に関与する塩基配列の多型検出については、有機リン系薬剤の標的分子であるコリンエステラーゼを対象に新たに検討を進める。
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