2017 Fiscal Year Research-status Report

ビタミンD受容体コファクターペプチドの網羅的合成と機能解析

Research Project

Project/Area Number	17K08373
Research Institution	Showa Pharmaceutical University
Principal Investigator	山本恵子昭和薬科大学, 薬学部, 教授 (90147017)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	ビタミンD / 核内受容体 / ビタミンD受容体 / コファクター / コアクチベーター / 結晶構造解析 / アゴニスト / アンタゴニスト
Outline of Annual Research Achievements	核内受容体の一員であるビタミンD 受容体（VDR）の構造解析を目的とし、VDRのリガンド結合ドメイン (LBD) の結晶構造解析に必要なコアクチベーターペプチドの網羅的合成を行うためにマイクロウェーブ固相合成装置を用いて合成を試みた。その結果、15種のコファクターペプチドの合成を完了した。初めに、樹脂上でペプチド鎖を構築した。続いてトリフルオロ酢酸とカルボカチオンスカベンジャーの酸混合溶媒で処理することで側鎖の脱保護と樹脂からの切り出しを同時に行った。その後、得られた粗ペプチドを高速液体クロマトグラフィーで分離し、飛行時間型質量分析装置を用いて目的のペプチドであることを確認した。現在までに11種のコアクチベーターペプチドについて精製及び構造確認まで完了した。次に、活性型ビタミンD誘導体存在下で、コファクターペプチドを用いてVDR-LBDの結晶化を行い、得られた結晶を用いてX線結晶構造解析を行った。その結果、コアクチベーターペプチドSRC2-3とVDR-LBD間で観測された2番目のチャージクランプが、コアクチベーターペプチドSRC2-2とVDR-LBD間では形成されないことが明らかになった。この違いはコアクチベーターペプチドに共通であるLXXLLモチーフの近縁のアミノ酸残基がSRC2-2とSRC2-3では異なることに起因していると考えられた。この結果は、コファクターペプチドを替えることで今まで検出できなかったVDR-LBDの新規構造を検出できる可能性につながる重要な知見であり、他の核内受容体の構造解析にも役立つことが期待できる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 合成した15種のコファクターペプチドのうち、11種は合成とそれに続く精製が完了し、残り4種は精製の段階にある。また、精製したコファクターペプチドを用いてVDR-LBDの結晶化およびX線結晶解析を行い、新たにコアクチベーターペプチドSRC2-2と活性型ビタミンD誘導体が結合したVDR-LBDの相互作用様式を明らかにした。よってほぼ順調に進展している。
Strategy for Future Research Activity	リガンド存在下15種のコファクターペプドを用いて96条件を使った網羅的な結晶化および結晶構造解析を行った後、リガンド非存在下でコファクターペプチドのうちコリプレッサーペプチドを用いて結晶化し、アポ体の構造解析を試みる。その後、コファクターペプチドと報告者のグループで合成した30以上の特色のあるリガンドを用いて構造解析を行う。さらに、表面プラズモン共鳴を用いてコファクターペプチドとVDR-LBDの網羅的相互作用解析を行う。
Causes of Carryover	合成できたコファクターペプチド15種の内、11種の精製を完了したが、残り4種の精製に着手できなかったため当該助成金が生じた。翌年度、精製のために使用する予定である。