カルバペネム抗菌薬をも不活化するメタロ-β-ラクタマーゼの阻害剤・検出剤の合成

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K08376
• Research Institution: Kinjo Gakuin University
• Principal Investigator: 黒崎 博雅 金城学院大学, 薬学部, 教授 (70234599)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 福石 信之 金城学院大学, 薬学部, 教授 (70248326)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: β-ラクタム剤 / 阻害剤 / 蛍光検出剤 / メタロ-β-ラクタマーゼ / X線結晶構造解析 / 薬剤耐性菌

Outline of Annual Research Achievements

β-ラクタム剤に対する薬剤耐性菌が増加してきており、院内感染や日和見感染症の起因菌として社会的問題となっている。β-ラクタム剤の耐性機構の主なものとしては、薬剤不活化酵素であるβ-ラクタマーゼの産生が挙げられる。β-ラクタマーゼは、細菌外膜と内膜の間のペリプラズム間隙に存在し、β-ラクタム環を加水分解することで薬剤の抗菌活性を消失させる。 本研究では、メタロ-β-ラクタマーゼに対する阻害剤並びに検出剤を設計・合成すること目的としている。今年度は、分子内に蛍光発色団とチオール基を有し、この二つの官能基間のスペーサー部位のメチレン鎖の長さを変えた蛍光検出剤の合成を行った。合成した１つの検出剤を用いて、本蛍光剤の２種類のメタロ-β-ラクタマーゼ（IMP-1とIND-7）に対する取り込み速度を蛍光ストップトフロー法により求めた。その結果、IMP-1が最も速く、IMP-1と比べてIND-7は0.05倍の取り込み速度であることがわかった。この原因として、基質ならびに阻害剤の結合認識と結合に重要なループ1の1つのアミノ酸の変異によるループ可動性が大きく関わっていると考えられる。次に、合成した蛍光剤のメタロ-β-ラクタマーゼ（IMP-1)非産生菌と産生菌の蛍光強度を比較した。染色方法は、蛍光剤を メタノールと緩衝溶液 (pH 7.4)に一定量溶かし、メタロ-β-ラクタマーゼ（IMP-1)非産生菌または産生菌を約２分インキュベートとしたのち、遠心分離した。上澄みを除去し、菌体にメタノールと緩衝溶液 (pH 7.4)を加え、よく洗ったのち、落射型蛍光顕微鏡により蛍光観察を観察した。メタロ-β-ラクタマーゼ非産生菌と比べて産生菌の方が蛍光強度が強いことがわかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

メタロ-β-ラクタマーゼを検出するための２つの新規な蛍光検出剤を合成し、標的酵素に対する蛍光検出剤の物理化学的特性を明らかにする事ができ、当初計画通りに進んでいると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

合成した蛍光検出剤はメタロ-β-ラクタマーゼ非産生菌と比べて産生菌の方が蛍光強度が強いことがわかったが、その蛍光強度の差は実用化に向けては不十分であると考えている。そのため、より蛍光検出剤の化学構造の最適化を図っていく必要がある。そのためには標的酵素と蛍光検出剤との共結晶を作成し、X線結晶構造解析により立体構造を決定する。決定した原子座標を利用して、構造の最適化を行う。

Causes of Carryover

今年度は、新規蛍光検出剤の化学合成が思っていたよりもスムーズに進行したため、当初見積もっていた化学合成用試薬の購入費が予想以上に少なくて済んだ。また次年度は、メタロ-β-ラクタマーゼの大量培養、さらには標的酵素と阻害剤または蛍光検出剤との共結晶の作成を行う予定である。そのため、これらの実験に必要な生物系試薬ならび器具の大量購入に当てたいと考えている。