2017 Fiscal Year Research-status Report
Development of Tiwan Habu-derived clot-busting agent
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17K08461
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| Research Institution | Teikyo Heisei University |
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Principal Investigator |
石田 功 帝京平成大学, 薬学部, 教授 (00415556)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大西 敦 帝京平成大学, 薬学部, 准教授 (50342762)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ヘビ毒 / 血栓溶解剤 / フィブリン分解酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
日本においても欧米と同様に、血栓症の罹患率、死因率の高さはトップクラスに位置しており、血栓症の予防、治療に関する研究の注目度は非常に高い。血管の梗塞部位解除に組換え組織プラスミノーゲン活性化因子（rtPA）の静脈注射は効果的であり、再狭窄についてはGPIIb/IIIa血小板受容体阻害剤により回避可能とされるが、活性化された血中プラスミンによる補体活性化、血小板凝集促進による副作用が問題となる。ガラガラヘビ毒由来メタロプロテアーゼ断片（Alfimeprase）は出血活性を持たず強力なフィブリン塊分解活性を持ち、rtPAのような副作用が予想されないため、米国で血栓溶解剤として臨床開発された。しかしながら、生理的条件下において、Alfimepraseは血清中のα2マクログロブリン（α2M）により不可逆的に速やかに不活性化されるため、期待された効果が見られず、第2相臨床試験でドロップした。
本研究で着目した台湾ハブ毒由来タンパク質TM3（Fibrinlysin）は、Alfimeprase様の分子であるが、フィブリン塊分解活性を持ち、α2Mには不活性化されないが出血活性を持つという欠点がある。出血活性は毒タンパク質の活性部位周辺の塩基性アミノ酸残基が基底膜と結合することで発現すると考えられており、TM3の活性部位周辺において特徴的な塩基性アミノ酸残基を特定し、出血活性を欠損したTM3変異体の作製を試みる。さらには、それにヒトプラスミノーゲンクリングルドメイン1（FBD）を融合することで、フィブリン塊に対して特異的なターゲッティング活性を持たせ、副作用の低減を図る。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
FibrinlysinとAlfimeprase の立体構造を分子モデリングにより比較した結果、Fibrinlysin に特徴的な塩基性アミノ酸Arg85, Arg106, Arg116, Lys133が見出された。この何れかの塩基性アミノ酸が出血活性に影響を与えることが予想される。また、Arg106は活性中心近傍に配置されることから、酵素活性に影響を及ぼす可能性がある。以上の結果から、Fibrinlysin三重変異体（R85T/R116G/K133N）（Mutant1）とFibrinlysin四重変異体（R85T/R106G/R116G/K133N）（Mutant2）遺伝子をデザインした。Fibrinlysin（Original）、Mutant1、Mutant2の遺伝子は人工合成し、バキュロウイルス発現系（bac to bacシステム）に導入した。しかしながら、作製した3種の組換えタンパク質は、全て分泌タンパク質として発現せず、TritonX-100による可溶化が必要であった。加えて、これら発現したタンパク質は、Refolding操作に必要であるグアニジン塩酸、CHAPSによる可溶化も困難であった。そのため、目的タンパク質のN末端にミツバチ毒メリチンのシグナルペプチドを付加した遺伝子をデザイン、作製し、再びバキュロウイルス発現系を用いて組換えタンパク質の発現を行った。その結果、シグナルペプチドを付加したOriginal、Mutant1、Mutant2は、可溶性タンパク質として培地中への分泌が確認できた。その後、分泌タンパク質は、His-Trapカラムを用いて精製を行ったがそれだけでは精製度が不十分であり、現在これらの組換えタンパク質は、DEAE-sepharoseカラム、TALONカラムにより精製中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
カラムを用いて精製した組換えタンパク質（Original、Mutant1、Mutant2）は、それぞれフィブリン分解（血栓溶解）活性の確認を行う。3種類の組換えタンパク質のフィブリン分解活性を確認した後、ウサギの耳に組換えタンパク質をそれぞれ注射し、出血活性の有無を調べる。
Originalに出血活性があり、Mutant1またはMuant2に出血活性がなければ、その変異体のDNA配列のN末端またはC末端にヒトプラスミノーゲンクリングルドメイン1（FBD）を付加した遺伝子を合成し、バキュロウイルス発現系で組換えタンパク質を発現・カラム精製を行う。作製したMutant1（またはMutant2）+FBDがフィブリン分解活性をもち、かつ出血活性が欠損していることを確認する。さらにMutant1（またはMutant2）+FBDがフィブリンコートディスクと特異的に結合することを確認する。
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| Causes of Carryover |
遺伝子組換えタンパク質の作製・精製に少なからず時間を費やしたため、タンパク質の活性を見るまでに至らず、石田分の費用がかからなかった。組換えタンパク質が精製され次第、活性を見るため、費用が発生する予定である。
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