2019 Fiscal Year Research-status Report
Development of Tiwan Habu-derived clot-busting agent
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17K08461
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| Research Institution | Teikyo Heisei University |
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Principal Investigator |
石田 功 帝京平成大学, 薬学部, 教授 (00415556)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大西 敦 帝京平成大学, 薬学部, 准教授 (50342762)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ハブ毒 / 血栓溶解剤 / フィブリン分解酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
欧米と同様に日本においても、血栓症の罹患率・死因率の高さはトップクラスに位置しており、血栓症の予防、治療に関する研究の注目度は非常に高い。血管の梗塞部位の解除には、組換え組織プラスミノーゲン活性化因子（rtPA）の静脈注射は効果的であり、再狭窄についてはGPIIb/IIIa血小板受容体阻害剤により回避が可能とされるが、血中プラスミン活性化による補体の活性化、血小板凝集促進による副作用が問題となる。ガラガラヘビ毒由来メタロプロテアーゼ断片（Alfimeprase）は、出血活性を持たずに強力なフィブリン塊の分解活性を持ち、且つrtPAのような副作用が予想されないため、米国で血栓溶解剤として臨床開発された。しかしながら、生理的条件下において、Alfimepraseは血清中のα2-macroglobulin （α2M）により不可逆的に且つ速やかに不活性化されるため、期待された血栓溶解効果が見られず、第２相臨床試験でドロップアウトした。
本研究で着目した台湾ハブ毒由来タンパク質TM3（Fibrinlysin）は、Alfimepraseのホモログであり、フィブリン塊分解活性を持ちα2Mには不活性化されないが、出血活性を持つという欠点がある。出血活性は、毒タンパク質の活性部位周辺に配置する塩基性アミノ酸残基が、基底膜と結合することにより発現すると考えられている。 TM3の活性中心周辺において、出血活性に関わると予想される特徴的な塩基性アミノ酸残基を特定し、出血活性を欠損したTM3変異体の作製を試みる。さらに、その変異体にヒトプラスミノーゲンクリングルドメイン1（FBD）を融合することで、フィブリン塊に対して特異的なターゲッティング活性を持たせることにより、プラスミン活性化による副作用のない血栓溶解剤開発の実現を進めていく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
Fibrinlysinの3重変異体（R85T/R116G/K133N）（Mutant1）、および4重変異体（R85T/R106G/R116G/K133N）（Mutant2）を設計し、分子モデリングにより、Originalと2つの変異体の立体構造を比較した結果、アミノ酸置換によるOriginalとの大きな構造変化、活性中心への影響は見られなかった。以上のことから、Mutant1、Mutant2は酵素活性に影響をおよぼす可能性は低いと判断し、Original 、Mutant1、およびMutant2の遺伝子を合成した。
合成した遺伝子は、Bac-to-Bac システムを使用して組換えタンパク質を発現させた。3種の組換えタンパク質は、膜タンパク質予測プログラムSOSUIでは可溶性タンパク質と予想されたにも関わらず、殆どが可溶性タンパク質としては発現しなかった。加えて、これら組換えタンパク質は、CHAPS、グアニジン塩酸による可溶化、さらにその後のRefolding操作が困難であったため、目的タンパク質のN末端側にミツバチ毒メリチンのシグナルペプチドを付加した遺伝子を合成し、再度Bac-to-Bac システムで組換えタンパク質の発現を行った。その結果、シグナルペプチドを付加したOriginal、Mutant1、Mutant2は全て可溶性タンパク質として培地中への分泌することが確認できた。しかしながら、精製を進めるに伴って、目的タンパク質は凝集、不溶化してしまった。目的タンパク質が不溶化しないような条件検討を探索しながら精製を進めたが現在までに有効な改善方法は見つかっていない。また、3種類の組換えタンパク質の粗精製品を用いてフィブリン分解活性を確認した結果、全てにおいてフィブリン分解活性が確認された。
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| Strategy for Future Research Activity |
Fibrinlysinを含むAlfimepraseのホモログは、ヘビ体内で前駆体として合成され、翻訳後にプロセシングを受けることにより、分泌タンパク質として機能することが分かっている。Fibrinlysin の遺伝子全長を調べた結果、Fibrinlysinは前駆体のC末端側にコードされていることから、Fibrinlysin前駆体のC末端側にタグ（His-Tag）を付加した遺伝子を合成し、Bac-to-Bac システムに導入して組換えタンパク質の発現を行う。目的タンパク質は、発現後速やかにカラム精製を行い、それぞれの精製標品についてフィブリン分解活性の確認を行う。フィブリン分解活性を確認した後、出血活性の有無を調べるために、ウサギの耳に精製標品を注射する。Originalに出血活性があり、Mutant1またはMuant2に出血活性がなければ、その変異体のN末端またはC末端にFBDを付加した遺伝子を合成し、Bac-to-Bac システムで組換えタンパク質を発現、精製する。作製したMutant1（またはMutant2）＋FBDがフィブリン分解活性をもち、且つ出血活性が欠損していることを確認する。さらに、Mutant1（またはMutant2）+FBDがフィブリンコートディスクと特異的に結合することを確認していく。
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| Causes of Carryover |
目的の組換えタンパク質は、膜タンパク質予測プログラムSOSUIから可溶性タンパク質であると予測された。しかし、Bac-to-Bac システムで発現させた組換えタンパク質は不溶性であった。また、目的のタンパク質にシグナルペプチドを付加し発現させると可溶性タンパク質として得られるが、精製を進めるに伴って不溶化する想定外の状況に直面し、現段階では精製標品の必要量を簡単に得ることは困難である。Fibrinlysinは、体内では前駆体として合成され、プロセシングを受けて分泌タンパク質として機能することから、Fibrinlysin前駆体のC末端にHis-Tagを付加した遺伝子を合成する。本来の形式に従って目的タンパク質を発現させることにより、可溶性タンパク質として獲得し、研究計画を速やかに進行させていく。
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