2017 Fiscal Year Research-status Report
パーキンソン病原因遺伝子産物PINK1が形成するシグナル系の最先端プロテオミクス
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17K08635
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
小迫 英尊 徳島大学, 先端酵素学研究所(オープンイノベ), 教授 (10291171)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | パーキンソン病 / PINK1 / キナーゼ / リン酸化 / プロテオーム / LC-MS/MS / Phos-tag / 質量分析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
家族性パーキンソン病の原因遺伝子産物として、セリン/スレオニンキナーゼPINK1 とユビキチン連結酵素Parkin が知られている。最近、PINK1 とParkin が協調して損傷ミトコンドリア上にリン酸化ユビキチン鎖を形成することにより、ミトコンドリア特異的なオートファジー分解を引き起こすことが明らかになった。しかしながら、PINK1の下流シグナル伝達系については不明な点が多い。そこで本年度は、様々な最先端プロテオミクス解析技術を組み合わせることにより、PINK1の標的基質を網羅的に同定することを試みた。PINK1を安定発現するHeLa細胞および親株のHeLa細胞に対し、無処理または脱共役剤で処理してから抽出液を調製した。まず我々が開発したIMACと2D-DIGEを組み合わせた方法により（Kosako et al., Nat. Struct. Mol. Biol., 2009）、既知のPINK1基質であるユビキチンがPINK1活性依存的にリン酸化されることを確認した。次に抽出液をトリプシン消化後にペプチドを10種類のTMT (tandem mass tag)試薬で標識した。標識ペプチドを混合後、IMACによってリン酸化ペプチドを精製し、さらにbRP (basic pH reversed phase)分画を行ってからLC-MS/MS解析を行った。その結果、約2万種類のリン酸化ペプチドの同定と定量に成功し、ユビキチンやPINK1自身と共に、Rabファミリータンパク質やオートファジーに関与するミトコンドリアタンパク質などを新規PINK1基質候補として見出した。さらにこのRabファミリータンパク質が細胞内でPINK1によってリン酸化されることをPhos-tagウェスタンブロット法によって確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
PINK1の下流基質を網羅的に同定するために、TMT標識、IMACによるリン酸化ペプチドの精製、およびbRP分画を組み合わせたリン酸化プロテオーム解析法を確立することができた。その結果、約2万種類ものリン酸化ペプチドを同定・定量することに成功した。その中でPINK1の活性化に依存してリン酸化が増加するペプチドには、既知のPINK1基質であるユビキチンやPINK1自身が含まれていたため、本方法の妥当性が確認できた。この大規模解析法は他のリン酸化シグナル伝達系にも適用可能な汎用性の高い方法である。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究により、PINK1の新たな下流基質を見出すことができたため、PINK1はリン酸化ユビキチン鎖の形成を介したミトコンドリア特異的なオートファジー分解とは別の役割も有していると考えられた。これらの新規PINK1基質とミトコンドリア機能やパーキンソン病などとの関連について、生化学・細胞生物学的な検討を進める予定である。また、ミトコンドリアの損傷に伴うPINK1の活性・局在・安定性などの調節機構について明らかにするために、PINK1が形成する複合体を免疫沈降/質量分析法によって大規模に同定する予定である。
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| Causes of Carryover |
高額な消耗品を必要とする網羅的定量リン酸化プロテオーム解析法の確立が予想以上にスムーズに進展したため、次年度使用額が生じた。次年度にはPINK1複合体を同定するための免疫沈降/質量分析に必要な消耗品に使用する予定である。
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Research Products
(5 results)
