新規NF-κB抑制因子による炎症性腸疾患における慢性炎症の制御機構

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K08795
• Research Institution: Niigata University of Health and Welfare
• Principal Investigator: 川村 宏樹 新潟医療福祉大学, 医療技術学部, 准教授 (20333495)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 樋口 雅也 金沢医科大学, 医学部, 教授 (50334678) ; 高橋 雅彦 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (80377192)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: マクロファージ / 炎症 / USP10 / サイトカイン

Outline of Annual Research Achievements

初めに1年目はマクロファージ細胞株sh-USP10 RAW264.7細胞とsh-NT RAW264.7細胞の増殖能を検討した。しかしながらRAW264.7細胞に対するUSP10の機能が、この細胞株特異的だという可能性があった。そこで新たにJ774.1マクロファージ細胞株でsh-USP10 J774.1細胞とsh-NTJ774.1細胞を用いて検討した。その結果、sh-USP10 J774.1細胞はsh-NT J774.1細胞に比べ、約80％の増殖能を保有していた。これはRAW264.7細胞が約50％と比べ異なるが、USP10によりマクロファージの増殖が抑えられることは明らかになった。サイトカイン産生能を検討するにあたり、1年目は培養時間が長いと細胞数に差がつき結果の解釈が困難であった。そこで培養条件の検討をおこなった結果、無刺激でもTNFα、MIP-2有意に増加した。LPS刺激をおこなった結果、MIP-2、TNFα、IL-6産生で有意な増加が認められた。これはRAW264.7細胞の結果と異なるが、条件検討の違いによるものだと推測された。
次にJ774.1細胞のUSP10とNF-κBの関係をレポータージーン解析で検討した。しかしながら、複数のベクター導入法を試みたが導入効率が悪く結果が出なかった。そこで293T細胞を使って同様な検討をおこなった。その結果、Tax存在下におけるNF-κBプロモーター活性はUSP10によって抑制された。さらにNF-κB の活性に関与る因子をスクリーニング的に組み合わせておこなった結果、Ｘ因子とＹ因子の存在下においても同様に顕著な転写抑制を誘導した。これ以外にもサイトカイン産生に重要なα因子とβ因子にもUSP10は作用して、炎症性サイトカインの産生に関与している可能性が推測された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

1年目にUSP10はNF-κBに作用して、マクロファージやT細胞のサイトカイン産生や増殖能に影響を与える結果を得ることが出来た。2年目（昨年度）は他のマクロファージでの検討で同様にサイトカイン産生や増殖能に影響を与える結果を得て、細胞株特異的ではない事を証明できた。またUSP10KD細胞にUSP10を戻した細胞を、変異体を含め3種類の作成を終了した。これは今年度の結果には間に合わないが、3年目準備も順調に進んでいる。加えて、これまでブラックボックスであったUSP10がNF-κBにどの様に作用しているのか、またサイトカイン産生にどの様に関与しているのか、について解明研究を進めることができた。しかしながら因子特定を進めた結果、J774.1細胞のIL-1β産生やマウス炎症反応に関する研究が遅れぎみである。よって研究全体を考えれば、おおむね順調に進展しているとい判断は妥当であると考える。

Strategy for Future Research Activity

昨年度までの進行状況や結果を踏まえて最終年度も、１．細胞内でのUSP10のNF-κBに対する制御機構の解明、２．USP10とNF-κBの関係する炎症反応への影響、３．炎症性腸疾患マウスモデルでの解析の３つを中心に研究に取り組む。
１．細胞内でのUSP10のNF-κBに対する制御機構の解明：　USP10とNF-κB の活性に関与るＸ因子とＹ因子の経路をすすめ制御機構を明らかにする。こサイトカイン産生に重要なα因子とβ因子の関与の有無を明らかにする。またＸ因子、Ｙ因子、α因子、β因子の各相互作用の検討もおこないたい。この実験には、USP10KD細胞にUSP10を戻した細胞やUSP10の多量発現細胞を用いる予定である。
２．USP10とNF-κBの関係する炎症反応への影響：　IL-1βを中心とした炎症性サイトカインへの影響を検討する。昨年度、J774.1細胞のIL-1β産生について、確定的な結果が得られておらず、方法の再検討を進める。その後、USP10活性化薬の一つであるレスベラトロールをin vitroの実験系にしようして、炎症抑制作用を検討する。
３．炎症性腸疾患マウスモデルでの解析：　引き続き、in vitroでの実験で得られた結果が、モデルマウス由来のマクロファージでも同様や否かUSP10とNF-κBを中心とした解析を更に進める。

Causes of Carryover

本報告書の「７．現在までの進捗状況」に記入した通り、USP10がマクロファージ細胞株の機能解析やNF-κB の活性解析などが、当初の予定より大幅に進み研究時間の多くの割合を使用した。それに伴い、IL-1βを中心とした炎症反応解析やマウス関連の実験時間が少なくなったので、関連する試薬代などの経費が減少した。最終年度は「８．今後の研究の推進方策」に記載した通り、炎症解析やマウス関連の解析をおこい今年度は繰り越した経費を使用する予定でいる。