2018 Fiscal Year Research-status Report
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17K08860
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
野間口 雅子 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 教授 (80452647)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | HIV-1 / Vif / スプライシング / 変異 / 適応 / 同義1塩基置換 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
HIV-1 Vifは、宿主細胞に存在する強力なウイルス抑制因子APOEC3Gと拮抗し、その発現量や機能はウイルス複製能を規定する主な要因の1つである。Vifの発現量調節機構には未解明な点が多く、この機構の解明は新たな複製制御手法の確立に役立つと期待される。申請者は、HIV-1ゲノムのスプライシングアクセプター（SA）1とドナー（SD）2の周辺領域において、自然に存在する種々の同義1塩基置換（nSNV）がVif発現量を増減させることを見出し、その領域をSA1D2proxと名付けた。Vif超低発現変異体NL-tacがAPOBEC3G高発現下でどのように適応するかを細胞内馴化実験により検討したところ、vifコード領域に1塩基置換（AdM1）を獲得することでVif発現量を増加させることが分かった。昨年度は、Vif発現量調節機構を調べるため、人工的な配列ではなく親株NL4-3本来の配列を持つミニゲノムを構築した。このミニゲノムを用いた実験で、プロウイルスクローンで得られたVif発現量変動の結果を反映することを確認した。
今年度は、AdM1によるNL-tacのVif発現量増加に関して解析した。まず、ミニゲノムを用いてスプライシングパターンの変化を調べた。Vif mRNA産生にはSD1とSA1のみでスプライシングが起こることが必須条件となる。NL-tac-miniでは、NL4-3-miniと比較してSD1/SA1でのスプライシング産物が著減し、逆にSD1/SA2産物が増加した。NL-tac-miniへのAdM1の導入は、NL-tac-miniと比べSD1/SA1産物を増加させるとともに、既報のSD2b（本来のSD2とは異なるスプライシングサイト）由来の産物を増加させた。AdM1の導入によりスプライシング効率や部位が変化することで、NL-tacのVif発現量が増加することが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度より、ミニゲノムを用いたVif発現量調節機構の解析を進めている。上述の通り、NL-tac-miniへのAdM1導入（tac+AdM1）によるVif発現量の増加においては、スプライシングパターンの変化が見られた。このようなパターンの変化はSA1D2prox内のnsSNVによっても認められた。これらの結果は、Vif発現量の変動が、スプライシングの変化と、続いて起こるmRNA産生量の変動により起こることを示唆した。スプライシングには多数の宿主因子とこれらの標的となる塩基配列が関与する。そこで、ミニゲノムの一定領域の配列（Vif発現量を変動させる1塩基置換を含む）を鋳型としてRNAを合成し、HeLa細胞の核タンパク質を用いてプルダウンアッセイを実施した。NL4-3-mini、NL-tac-miniとtac+AdM1由来の各RNAについて、プルダウン後のタンパク質を電気泳動により比較した。サンプル間で明瞭な違いが観察されなかったため、当研究室で保有するスプライシング関連因子の抗体を用いて検出を試みた。その結果、ある種のスプライシング因子群が、NL4-3-miniやtac+AdM1由来のRNAに比べてNL-tac-mini由来のRNAに、より多く結合していることが分かった。これは、NL-tacでは、検出されたスプライシング因子群が結合することにより、SA1でのスプライシングが抑制され、その結果、Vif発現量が減少しているのではないかと考えられた。Vif発現量調節機構に関してRNAプルダウンアッセイの条件等を検討する必要があるが、スプライシング因子群の結合については、さらに詳細に解析中であり、研究は概ね順調に進捗していると判断している。
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| Strategy for Future Research Activity |
上述のNL-tacだけでなく、他のVif低発現変異体やVif過剰発現変異体を用いて細胞での馴化実験を行い、幾つかのVif発現量を変動させる適応変異の情報を得ている。これらの変異情報を基に、Vif発現量調節に関与する部位・領域ならびにその塩基配列を明らかにしていく。
本研究課題の遂行により、HIV-1ゲノムにおいて、Vif発現調節に関与する領域は当初想定していたよりも広範囲に渡ることが分かってきた。HIV-1のサブタイプではVifの抗APOBEC3G活性が異なることが知られている。異なるサブタイプのSA1D2proxおよびvif配列を利用し、SA1D2proxとvifのサブタイプ間の組み合わせ、あるいは、サブタイプ間のキメラvifをコードする複数のプロウイルスクローンを作製した。これらのプロウイルスクローンの中には、親株NL4-3と比較してVif発現量が大きく変動するものが認められた。このことは、SA1D2proxだけでなく、vifコード領域の塩基配列もVif発現量の決定に関与することを示す。一方、ミニゲノムを用いた解析等から、Vif発現量が増加する、つまり、SA1でスプライシングされた産物が増える時には、SA2でのスプライシング産物が減少することが分かった。SA1とSA2でのスプライシングは逆相関することを意味する。SA2は、vifコード領域内に存在し、vpr mRNA産生に重要なスプライシングサイトである。従って、Vpr発現量調節に関与する塩基配列は、Vif発現量調節にも関与すると予測される。前述の結果と併せて、vifおよびvprコード領域の塩基配列においても、Vif発現量調節に寄与する配列を探索中である。
以上の実験により、Vif発現量を変動させるHIV-1ゲノムの塩基配列、および、その調節機構について包括的に理解することを目指す。
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Research Products
(7 results)
