Development of a method to induce apoptosis by HIV locked in a cell

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K08861
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 藤田 美歌子 熊本大学, 薬学部附属創薬研究センター, 准教授 (00322256)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大塚 雅巳 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 教授 (40126008)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: HIV根絶 / Gag / MA / イノシトールリン脂質 / HIV放出抑制 / アポトーシス / DSFアッセイ / 細胞内導入キャリア

Outline of Annual Research Achievements

現在のエイズ治療における最大の目標は、HIV潜伏感染細胞の感染者体内からの除去である。これまでに研究代表者らは、非天然型のイノシトールリン脂質誘導体L-HIPPOを開発した。このL-HIPPOはHIVのGag蛋白質に強く結合してHeLa細胞からのHIV放出を抑制し、おそらく閉じ込められたウイルス蛋白質により細胞にアポトーシスが誘導される。この現象をLock-in and apoptosisと名付けた。これをHIV潜伏感染細胞の除去法として臨床試験に使用できるところまで発展させることが、本研究の目的である。そのために当初、平成29年度においてアポトーシス誘導機序の解明と、L-HIPPOのプロドラッグ化を行うことを計画した。
その一方で、これまでの研究成果をまとめ論文投稿を行っていた。平成28年度末になって、実験の要求が来た。そのため平成29年度の初めは、T細胞内でLock-in and apoptosisを示すことに時間を費した。結局はT細胞株でもこの現象を示し、論文は受理された。しかし、アポトーシスに至る細胞の割合はHeLa細胞に比べて少ないことがわかった。そこでT細胞株でのアポトーシス誘導効率を改良してから、その機序の解明をT細胞株で行うことにした。これまで負電荷を多く持つL-HIPPOをキャリアにより細胞に導入してきたが、まずこの方法で導入効率が十分かどうかがわからない。そこで、細胞内のL-HIPPOの定量法の開発に取り組んでいる。一方、L-HIPPOのプロドラッグ体の合成は中間体の合成まで至っている。
さらにL-HIPPOが結合するGag蛋白質のMAドメインおよび各種変異体の発現、精製に成功したため、MAまたはその変異体とL-HIPPOの相互作用をDSFアッセイにより調べた。特筆すべきこととして、MAとL-HIPPOが結合することにより、蛋白質の不安定化が示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初は、平成29年度においてアポトーシス誘導機序の解明と、L-HIPPOのプロドラッグ化を行うことを計画した。このうち、前者についてはT細胞で行う必要性が明らかとなったために、T細胞株でのアポトーシス誘導効率を改良後に行うことにした。後者については途中段階である。しかしいくつかの成果を得ることができた。重要であると考えられるものを以下に挙げる。
(1)L-HIPPOが結合するMAドメインを大腸菌で発現させて精製し、純度の高いMA蛋白質を大量に調整することができた。これにより、様々な物理化学的手法による解析が可能となった。(2)精製蛋白質を用いたDSFアッセイにより、MA蛋白質そのもののTm値は58.2℃であるが、L-HIPPOが結合すると50.8℃に下がることが明らかになった。このことより、L-HIPPOがMA蛋白質を不安定化させることが示唆される。すなわち、不安定化した蛋白質が蓄積するストレスにより細胞にアポトーシスが誘導される、というこれまでには予想できなかった仮説を立てることができた。(3)HeLa細胞中でのアポトーシス誘導効率とは異なるものの、T細胞株であるJurkatでもLock-in and apoptosisの現象を示すことができた。患者体内の潜伏感染細胞の主なものはT細胞と考えられており、このことは本方法が臨床応用可能であることを示す。(4)これまでの成果をScientific Reportsに掲載することができた。この論文には大きな反響があり、新聞やWebの科学サイトなど様々なところに取り上げられた。このジャーナルの2017年のTop 100（高いアクセス回数があったもの）にも選ばれ、さらに世界の研究者やエイズ患者からもメールで問い合わせを受けた。

Strategy for Future Research Activity

本研究の目的は変わらず、Lock-in and apoptosis法をHIV潜伏感染細胞の新しい除去法として、臨床試験に使用できるところまで発展させることである。そのために以下に示すように研究を推進する。
(1)MA蛋白質にL-HIPPOがどのように相互作用するのか、精製したMAおよびその変異体を用いて解析する。種々の物理学的解析を行う。またこれらの共結晶を調整し、X線結晶解析を行う。(2)(1)と同時にT細胞株でのLock-in and apoptosisの効率を改善する。まず、細胞内のL-HIPPO量の測定法を確立する。今まで用いてきた細胞内導入キャリアにより、L-HIPPOがT細胞内にどのくらい入るのか調べる。量が十分でなければ、キャリアの検討やプロドラッグ体の合成により導入量を上げ、アポトーシス効率を調べる。その効率が依然として十分でなかった場合、T細胞内でのHIV蛋白質発現量が不十分であることに起因する可能性がある。そこで、様々な転写増強剤との併用を検討する。(3)(2)が終了したら、改善した条件を用いて細胞内でのアポトーシス誘導機序を調べる。アポトーシスに関わるHIV蛋白質の同定や、宿主内でのアポトーシス誘導経路を調べる。ここで特に、不安定化した蛋白質が蓄積するストレスにより細胞にアポトーシスが誘導される、という仮説が正しいかどうかも調べる。(4)(1)および(3)で得られた知見に基づき、T細胞株内でのLock-in and apoptosisの効率を改善する。L-HIPPOプロドラッグ体の誘導体を設計し、合成、および評価を行う。結果を見て再度設計、合成、評価を繰り返し、効率を上げる。(5)最終的には、リザーバーモデルを用いて評価する。ここで効果が十分でなければ(4)に戻り、最後には臨床試験に使用できるところまで改良する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Stanford PULSE Institute(米国)
  • Country Name: U.S.A.
  • Counterpart Institution: Stanford PULSE Institute
• [Journal Article] Introduction of H2C2-type zinc-binding residues into HIV-2 Vpr increases its expression level. (2018)
  • Author(s): Koga, R., Yamamoto, M., Ciftci, H.I., Otsuka, M., and Fujita, M.
  • Journal Title: FEBS Open Bio Volume: 1 Pages: 146-153
  • DOI: 10.1002/2211-5463.12358
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Design, synthesis and biological evaluation of novel 1,3,4-Thiadiazole derivatives as potential antitumor agents against chronic myelogenous leukemia. Striking effect of nitrothiazole moiety. (2018)
  • Author(s): Altintop, M.D., Ciftci, H.I., Radwan, M.O., Sever, B., Kaplancikli, Z.A., Ali, T.F.S., Koga, R., Fujita, M., Otsuka, M., and Ozdemir, A.
  • Journal Title: Molecules Volume: 23 Pages: 59(1-17)
  • DOI: 10.3390/molecules23010059
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] The first pentacyclic triterpenoid gypsogenin derivative exhibiting anti-ABL1 kinase and anti-chronic myelogenous leukemia activities. (2018)
  • Author(s): Ciftci, H.I., Ozturk, S.E., Ali, T.F.S., Radwan, M.O., Tateishi, H., Koga, R., Ocak, Z., Can, M., Otsuka, M., and Fujita, M.
  • Journal Title: Biological and Pharmaceutical Bulletin Volume: 41 Pages: 570-574
  • DOI: 10.1248/bpb.b17-00902
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Blockade of TGF-beta/Smad signaling by the small compound, HPH-15, ameliorates experimental skin fibrosis. (2018)
  • Author(s): Huy, L.V., Chino, T., Oyama, N., Matsushita, T., Sasaki, Y. Ogura, D., Niwa, S., Biswas, T., Hamasaki, A., Fujita M., Okamoto, Y., Otsuka, M., Ihn, H., and Hasegawa, M.
  • Journal Title: Arthritis Research & Therapy Volume: 20 Pages: 46(1-13)
  • DOI: 10.1186/s13075-018-1534-y
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A novel inhibitor of farnesyltransferase with a zinc site recognition moiety and a farnesyl group. (2017)
  • Author(s): Tanaka, A., Radwan, M.O., Hamasaki, A., Ejima, A., Obata, E., Koga, R., Tateishi, H., Okamoto, Y., Fujita, M., Nakao, M., Umezawa, K., Tamanoi, F., and Otsuka, M.
  • Journal Title: Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters Volume: 27 Pages: 3862-3866
  • DOI: 10.1016/j.bmcl.2017.06.047
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] A clue to unprecedented strategy to HIV eradication: “Lock-in and apoptosis”. (2017)
  • Author(s): Tateishi, H., Monde, K., Anraku, K., Koga, R., Hayashi, Y., Ciftci, H.I., DeMirci, H., Higashi, T., Motoyama, K, Arima, H., Otsuka, M., and Fujita, M.
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 7 Pages: 8957(1-8)
  • DOI: 10.1038/s41598-017-09129-w
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] A dithiol compound binds to the zinc finger protein TRAF6 and suppresses its ubiquitination. (2017)
  • Author(s): Koga, R., Radwan, M.O., Ejima, T., Kanemaru, Y., Tateishi, H., Ali, T.F.S., Ciftci, H.I., Shibata, Y., Taguchi, Y., Inoue, J., Otsuka, M., and Fujita, M.
  • Journal Title: ChemMedChem Volume: 12 Pages: 1935-1941
  • DOI: 10.1002/cmdc.201700399
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] HIV study aiming at elucidation of viral evolution tactics and development of a way for eradication. (2018)
  • Author(s): Mikako Fujita
  • Organizer: The 4th International Symposium on Pharmaceutical and Biomedical Sciences
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Kinase Inhibitory Activity of Glycyrrhetic Acid. (2018)
  • Author(s): Halil I Ciftci, Mohamed O Radwan, Masami Otsuka, Mikako Fujita
  • Organizer: The 4th International Symposium on Pharmaceutical and Biomedical Sciences
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] HNEを標的とした新規脳保護薬 (2018)
  • Author(s): Tanima Biswas, Taha Farouk Shehata Ali, 平尚未、古賀涼子、森美晴、岡本良成、藤田美歌子、折戸公彦、野口慶、三好淳子、森岡基浩、大塚雅巳
  • Organizer: 日本薬学会第137年会
• [Presentation] Structural Basis of Targeting HIV-Gag Matrix. Towards Finding a Cure for HIV Infection. (2017)
  • Author(s): Halil Ibrahim Ciftci, Hiroshi Tateishi, Kotaro Koiwai, Ryoko Koga, Fumiaki Yumoto, Toshiya Senda, Masami Otsuka, Mikako Fujita
  • Organizer: The Second Japan-Turkey International Symposium on Pharmaceutical and Biomedical Sciences
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Zinc-Binding State of HIV-2 VPX/VPR Regulates Their Protein Stability. (2017)
  • Author(s): Ryoko Koga, Minami Yamamoto, Haruna Fujino, Kazunori Shimagaki, Halil Ibrahim Ciftci, Masahiro Kamo, Hiroshi Tateishi, Masami Otsuka, Mikako Fujita
  • Organizer: The Second Japan-Turkey International Symposium on Pharmaceutical and Biomedical Sciences
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] New Sirt2 Inhibitor Based on S-Triryl-L-cysteins Scaffold. (2017)
  • Author(s): Mohamed Osman Radwan, Taha F. S. Ali, Halil Ibrahim Ciftci, Ryoko Koga, Yoshinari Okamoto, Mikako Fujita, Masami Otsuka
  • Organizer: The Second Japan-Turkey International Symposium on Pharmaceutical and Biomedical Sciences
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Host Factor vs Virus: Characters of Viral Restriction Proteins and Anti-viral Strategy. (2017)
  • Author(s): Mikako Fujita
  • Organizer: Turkish-Japanese Workshop on Bioorganic Medicinal Chemistry and Natural Products
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Structural Basis of the Interaction between HIV-1 Gag Matrix and IP6. Toward the Development of IP6 Derivative. (2017)
  • Author(s): Halilibrahim Ciftci, Hiroshi Tateishi, Kotaro Koiwai, Ryoko Koga, Masami Otsuka, Mikako Fujita, Fumiaki Yumoto, Toshiya Senda
  • Organizer: 第65回日本ウイルス学会学術集会
• [Presentation] HIV-2 Vpx/Vpr蛋白質の発現量は亜鉛結合によって制御されている (2017)
  • Author(s): Ryoko Koga, Minami Yamamoto, Hiroshi Tateishi, Halilibrahim Ciftci, Masami Otsuka, Mikako Fujita
  • Organizer: 第65回日本ウイルス学会学術集会
• [Presentation] ウイルス蛋白質蓄積によりアポトーシスを誘導する新規抗HIV薬の創製 (2017)
  • Author(s): 立石大、門出和精、古賀涼子、林祐也、東大志、本山敬一、有馬英俊、安楽健作、藤田美歌子、大塚雅巳
  • Organizer: 第35回メディシナルケミストリーシンポジウム
• [Presentation] TRAF6 polyubiquitination interruption by a low molecular weight zinc chelator (2017)
  • Author(s): Mohamed O. Radwan, Ryoko Koga, Tomohiko Ejima, Yosuke Kanemaru, Hiroshi Tateishi, Taha F. S. Ali, Halil Il Ciftci, Yuri Shibata, Yuu Taguchi, Jun-ichiro Inoue, Masami Otsuka, Mikako Fujita
  • Organizer: 第35回メディシナルケミストリーシンポジウム
• [Presentation] HIV-2 Vpxのポリプロリンモチーフの役割 (2017)
  • Author(s): 島垣和功、古賀涼子、Halil Ibrahim Ciftci、大塚雅巳、山口佳宏、藤田美歌子
  • Organizer: 第31回日本エイズ学会学術集会
• [Presentation] Structural Basis of HIV-1 Gag Matrix Targeting by IP6 Derivative. (2017)
  • Author(s): Halil I. Ciftci, Hiroshi Tateishi, Kotaro Koiwai, Ryoko Koga, Masami Otsuka, Fumiaki Yumoto, Toshiya Senda
  • Organizer: 第31回日本エイズ学会学術集会
• [Presentation] Structural basis of inositol phosphates recognition in the HIV-1 gag matrix. (2017)
  • Author(s): Halilibrahim Ciftci, Hiroshi Tateishi, Kotaro Koiwai, Ryoko Koga, Masami Otsuka, Mikako Fujita, Fumiaki Yumoto, Toshiya Senda
  • Organizer: 第40回日本分子生物学会年会
• [Remarks] 今までにないエイズウイルス感染細胞除去法の開発―エイズ完治への第一歩―
  • URL: https://www.kumamoto-u.ac.jp/whatsnew/seimei/20170822
• [Remarks] 立石大大学院生の論文がプレスリリース及び熊本日日新聞に掲載されました
  • URL: http://www.pharm.kumamoto-u.ac.jp/Labs/bunsigouseiHP/research/symposium.html