可塑性関連プロテアーゼ・ニューロトリプシンによる痛覚・痒み感覚の修飾

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K09047
• Research Institution: Hyogo Medical University
• Principal Investigator: 山中 博樹 兵庫医科大学, 医学部, 講師 (20340995)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 脊髄後角 / 後角ニューロン / 後角サーキット / 可塑性 / 細胞外環境修飾

Outline of Annual Research Achievements

本年度はin situ hybridizationと免疫組織化学の二重標識を行い、脊髄後角ニューロトリプシン陽性ニューロンがGABA、glycine、パルブアルブミン等の抑制性ニューロンのマーカーであるpax2,興奮性ニューロンのマーカーであるlmx1bとの共存を確認することで興奮・抑制のどちらに関与しているのかを検討した。統計的な処理が終わっていないが、ほぼ興奮性のニューロンでの特異的な発現が推測できた。痒み処理系の脊髄後角ニューロンでの検討は難航しており、マーカーとなる物質の局在が現在入手可能な抗体では確認できていない。このため、痒み系のニューロンとの検討はmRNAレベルで行う事となり、本年度はガストリン分泌ペプチド陽性ニューロンの標識に使用するin situ hybridizationの条件を確認した。投射ニューロンでの発現についてはSubstance Pの受容体であるNK-1の発現がマーカーとなり得たが、細胞体の染色が乏しく突起上の発現のみが確認されたため、ニューロトリプシンmRNAとの二重標識は評価が難しい結果となった。このため、痒み系のニューロン群と同様にmRNAレベルでの発現確認による二重標識を行う事となり、NK-1 mRNA の標識を確認することとなった。NK-1 mRNA発現細胞の脊髄後角での可視化はニューロトリプシンとの共発現を検討するのに十分な感度が得られたため、これに使用するサンプルを調整している。従って、本年度はマーカー類の可視化とニューロトリプシン発現細胞を同定する事に多くの時間を要した事で計画の遅延を生じたが、これらは次年度早々に結果を得られる予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

脊髄後角以外のニューロンからの投射によるニューロトリプシンの発現を脊髄後角に認めたため、主要な投射をもつ後根神経節ニューロンでの発現確認を行ったところ、脊髄後角以上の転写活性を認めた。この成分を可視化して脊髄後角のニューロトリプシンと弁別するために様々なマーカータンパクとの共存関係を検討する必要に迫られた。このマーカータンパクの抗体による染色は抗体の購入から条件設定をする必要があったため、サンプルの作製と併せて3ヶ月程度の遅延を生む結果となった。

Strategy for Future Research Activity

脊髄後角でのニューロトリプシンの発現細胞の確認の後、その細胞種に応じた適刺激を行う。カプサイシン、ピンチ、痒み物質の投与を行って誘導されたc-fosとの二重標識を行いニューロトリプシンの発現が刺激に応答した成分で認められるかどうかを検討する。
報告されている基質であるagrinの断片化を検討し、ニューロトリプシンの活性が変化しているかどうかを上記の刺激後に検討する。
ニューロトリプシンの活性阻害を行い、適刺激反応への行動を検討する。

Causes of Carryover

最終年度において予定した実験を行うため必要な物品を購入するため、未使用額を次年度に使用する予定である。