2017 Fiscal Year Research-status Report

上皮間葉転換遺伝子データより見出された遺伝子の機能解析及び薬剤感受性に関する検討

Research Project

Project/Area Number	17K09376
Research Institution	Hamamatsu University School of Medicine
Principal Investigator	山出美穂子浜松医科大学, 医学部, 助教 (10464124)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	古田隆久浜松医科大学, 医学部附属病院, 准教授 (10303546)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	上皮間葉転換 / EMT / がん転移浸潤 / 遺伝子発現
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、がんの転移浸潤メカニズムのひとつである上皮間葉転換 (Epithelial-Mesenchymal Transition: EMT) を制御する新規遺伝子を検索・検討するものである。具体的には、米国National Institutes of Healthの研究室で一般公開されているNCI-60 cell lines をはじめとする複数のがん細胞・がん組織データベースより検索・検出し、その遺伝子のEMTにおける役割を明らかにすることで、がん転移浸潤のメカニズムの解明および新たながん治療法の開発に貢献することを目的としている。また、近年 EMT 制御遺伝子の発現レベルとがん薬物療法の感受性や予後との関連性が報告されており、本遺伝子においても現在化学療法に用いられている薬剤の感受性に与える影響を解析し、がん薬物療法の新たなバイオマーカーとなるか探ることも目的としている。今年度は、まずNIH/NCIで公開されている、がん細胞・がん組織の遺伝子データベースをもとに、既存のEMT関連遺伝子の発現パターンより新規遺伝子を検索・検出し、当該遺伝子 LIX1-like(LIX1L)の発現レベルを大腸癌細胞株で調査した。次に、LIX1Lの発現レベルをノックアウトしたKO細胞を、CRISPR-CAS9 systemを用いて作成した。作成したKO細胞のLIX1L発現レベルおよびEMT関連遺伝子のタンパク発現レベルをWild typeの細胞株（WT細胞）と比較検討している。また、細胞の転移浸潤能を比較検討する実験を開始している。また遺伝子LIX1Lに止まらず、その他の新規EMT関連遺伝子についてもデータ解析を継続している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason がん細胞・がん組織の遺伝子発現データベース解析をもとに、がんの転移浸潤に関与するEMT関連遺伝子と同等の発現パターンを示す遺伝子LIX1Lを割り出し、同遺伝子について大腸癌細胞株を用いて実験を開始した。まず大腸癌細胞株RKOのLIX1L発現レベルが高いことを確認した。次いで、CRISPR/Cas9 systemにより、RKO細胞株のLIX1L-KO細胞を樹立した。WT細胞とKO細胞を用い、LIX1L遺伝子発現レベルを比較、確認した。次に、WT細胞とKO細胞を用い、Wound healing assayにより細胞の移動能を比較検討した。現在、確認実験中であるが、WT細胞がより早いhealingを示す傾向にある。また、Migration asssayにおいては、KO細胞がより高度の浸潤能を示す傾向にあり、こちらも確認実験を進行中である。至適実験条件が整い次第、Invasion assayを行う。あわせて、WT細胞、KO細胞の、EMT関連遺伝子発現について、Western blottingによりタンパク発現レベルを、またqRT-PCRによりmRNA発現レベルを比較検討中である。
Strategy for Future Research Activity	現在進行中の、Wound healing assayおよびMigration assay、Invasion assayにより、LIX1L遺伝子のノックアウトにより大腸がん細胞の移動・浸潤能に変化が起こるかを明らかにする。また、タンパク・mRNAレベルでの遺伝子発現状況を比較検討し、既知のEMT関連遺伝子、制御遺伝子にLIX1Lのノックアウトが影響を与えるかどうかを調査する。以上の検討により有意な差が確認された場合、マウスモデルにおける実験の準備を始めることを検討する。また、抗腫瘍薬の殺細胞効果やDNA傷害にLIX1L遺伝子発現レベルが関与しているかを比較検討する実験を開始する。