2018 Fiscal Year Research-status Report
クロイツフェルト・ヤコブ病のタイプを鑑別可能なコンビネーションQUIC法の構築
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17K10022
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
森 剛志 宮崎大学, 医学部, 助教 (40426565)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 克也 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(保健学科), 教授 (70398147)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | クロイツフェルト・ヤコブ病 / QUIC法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
孤発性クロイツフェルト・ヤコブ病を代表とするプリオン病には病理像の異なる様々なタイプ（病理型）が存在し、それにより予後が異なるが、生前の診断や鑑別が困難な例も多い。本研究の目的は、プリオン病発症に関与する異常型プリオン蛋白（PrP）を早期検出可能にした試験管内異常型プリオン蛋白増幅法（RT-QUIC法）をさらに改良させることで、プリオン病のタイプを早期に鑑別できる手法を確立することである。本法は基質としてリコンビナントPrP（recPrP）を要するが、RT-QUIC法はこのrecPrPの配列に依存すると考えられている。そこで、どの配列が重要なのか、またそれはタイプ毎に異なるのかを確かめる。
前年度は、プリオン病タイプ間におけるRT-QUIC反応感受性を制御している重要配列を同定するために複数のPrPペプチドを用いて競合阻害実験を行った。従来のRT-QUIC 反応液にPrPペプチドを単一、もしくは2種類加えて、タイプの異なる患者脳乳剤試料を用いて凝集反応を観た。日本で大半を占める3型の脳乳剤を用いて検討したところ、単一のPrPペプチドを加えることで、MM1型およびMM2視床型脳乳剤のQUIC反応に遅延効果を示すペプチドが得られた。MM2皮質型脳乳剤においては大きな遅延効果は得られなかった。効果を示したペプチドについて２種類同時に加えてQUIC反応を試みたところ、MM2視床型において遅延効果が観られた。しかしながらその差はわずかであった。
平成３０年度は、遅延効果を示した領域を欠失させたリコンビナント蛋白のデザイン設計およびそのリコンビナント蛋白発現遺伝子の構築を進めた。今後は、これら構築したリコンビナント蛋白を基質としたRT-QUIC解析を試みる。また、今年度構築できなかったリコンビナント蛋白についても進めていく。また、効果のあったペプチド3種類加えたQUICは現在も進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
単一ペプチドを用いた競合阻害実験は、全て行い、それにより、QUIC反応を遅延させるペプチドが得られた。２種類のペプチドを同時に加えた２種混合QUICおよび3種混合QUICは現在進行させている。現在、効果の得られたペプチド配列を欠失させたリコンビナント蛋白recPrPの構築を進めている。いくつかのリコンビナント蛋白は構築したが、不思議なことに配列の違いにより得られるリコンビナント蛋白の回収量が異なる結果が得られた。この回収量の違いは、ベクター側を改良することで改善される場合もあることも理解してきた。
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| Strategy for Future Research Activity |
3種混合QUICによる競合阻害実験、および効果を示さなかったPrPペプチドを用いた２種混合QUICの競合阻害実験は現在進めている。また、効果を示した配列を欠失させたリコンビナント蛋白recPrPのデザイン設計およびリコンビナント蛋白発現遺伝子の構築は今、現在進めている。いくつかリコンビナント蛋白は構築済みである。これらはRT-QUIC法の基質として用いる。また、構築したリコンビナント蛋白等については２次構造の相違を比較する。
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| Causes of Carryover |
（理由）今年度はペプチドを用いた実験の他に様々な配列のリコンビナント蛋白の発現遺伝子の構築を遂行した。今年度購入予定であったNi-NTAスーパーフローアガロースはRT-QUIC法に用いるこれらのリコンビナント蛋白の精製に有用である。現在、リコンビナント蛋白のデザイン作成およびリコンビナント発現遺伝子の構築を進めており、いくつかの遺伝子は構築済みである。そのため、今後Ni-NTAスーパーフローアガロースは必要となるため、次年度購入することに変更した。
（使用計画）現在、様々な領域を欠失させたPrPのリコンビナント蛋白を構築した。また、さらに異なる領域を欠失させたリコンビナント蛋白の設計およびリコンビナント発現遺伝子の構築を進めている。これらリコンビナント蛋白の精製にNi-NTAスーパーフローアガロースを用いる。また、精製したリコンビナント蛋白については令和元年度の実験遂行のために使用する。
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[Presentation] Simultaneous addition of digitonin, heparin and arginine ethyl ester improves in vitro amplification of PrPSc derived from various prion strains.2018
Author(s)
Imamura M, Tabeta N, Matsuura Y, Iwamaru Y, Kitamoto T, Ma J, Mohri S, Murayama Y, Takatsuki H, Mori T, Atarashi R
Organizer
APPS2018
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[Presentation] Highly sensitive detection of PrPSc derived from various prion strains by simultaneous addition of digitonin, heparin and arginine ethyl ester to protein misfolding cyclic amplification.2018
Author(s)
Imamura M, Tabeta N, Matsuura Y, Iwamaru Y, Kitamoto T, Ma J, Mohri S, Murayama Y, Takatsuki H, Mori T, Atarashi R
Organizer
Prion 2018
