2018 Fiscal Year Research-status Report
グリアに着目した急性脳炎・脳症の病態解明と新規治療法の開発
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17K10086
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| Research Institution | Aichi Medical University |
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Principal Investigator |
倉橋 宏和 愛知医科大学, 医学部, 講師 (30621817)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
垣田 博樹 愛知医科大学, 医学部, 講師 (40528949)
奥村 彰久 愛知医科大学, 医学部, 教授 (60303624)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | サイトカイン / iNOS / ミクログリア / ミエリン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
グリアは脳内微小環境の恒常性維持に関与し、その機能異常は中枢神経疾患に関与しうるが、従来の急性脳炎・脳症研究はニューロンの障害を対象としたものがほとんどで、グリアに着目した研究は乏しい。現在、急性脳炎・脳症に対して明らかに有効といえる治療法はないが、グリアの役割を明らかにすることは新規治療の開発につながる可能性がある。
ラットの脳からミクログリアを分離培養し、LPSと低酸素・低糖濃度環境刺激に対する反応を観察した。刺激は単独または両者を組み合わせて負荷し、炎症性サイトカインTNFα、IL-6、IL-1βおよび一酸化窒素合成酵素（iNOS）を測定した。その結果、LPS刺激では炎症性サイトカインとiNOSの上昇を認めたが、低酸素・低糖濃度刺激のみではiNOSのみ上昇し炎症性サイトカインの上昇を認めなかった。LPS及び低酸素・低糖濃度環境を組み合わせた場合は、iNOSがより高値となり、炎症性サイトカインは上昇するもののLPS単独刺激ほどは上昇しなかった。
これらの結果から、低酸素・低糖刺激のみでは急性脳炎・脳症のモデルとなりうる反応を惹起することは困難であること、低酸素・低糖刺激とLPS刺激では、ミクログリアで惹起される反応が異なることを示唆し、急性脳炎・脳症を一元的な機序で説明することの困難さを反映していると考えられた。
脳炎・脳症に関与するその他の因子として、ミエリンが挙げられる。我々は、可逆性脳梁膨大部病変を有する軽症脳炎・脳症（MERS）の家族例2家系において、MYRF遺伝子にミスセンス変異を同定した。MYRFはミエリン関連遺伝子の発現に関与しており、急性脳症に関与する多様な病態の解明についての重要な手がかりとなりうる。今後は、MYRFによって発現が制御されている遺伝子と脳炎・脳症との関連を解析することで、脳炎・脳症の機序の解明および治療法の開発につなげたい。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
培養ミクログリアを用いた実験系で、サイトカインや環境温変化などの各種刺激による変化の測定を行った。今年度はLPS刺激、低酸素・低糖濃度刺激についての解析に加えて、高温（37℃）および低温（34℃）での反応の違いについて解析した。その結果、低温ではLPS刺激による炎症性サイトカインおよびiNOsの放出が抑制された。これらの結果を踏まえても、低酸素・低糖刺激のみでは急性脳炎・脳症のモデルとなりうる反応を惹起することは困難であった。
急性脳炎・脳症の遺伝学的背景の解明のための遺伝子解析では、可逆性脳梁膨大部病変を有する軽症脳炎・脳症（MERS）の家族例2家系において変異が同定されたMYRF遺伝子を軸に解析を行なった。反復性および家族性のMERS症例を対象に、MYRFで制御される可能性のある約700の遺伝子についてのバリアントを次世代シーケンサーを用いて解析し、神経疾患をもたない対照群と比較した。その結果、バリアントをもつ遺伝子の数には差を認めなかったが、MERS症例と対照群ではバリアントを認める遺伝子が異なっていた。
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| Strategy for Future Research Activity |
ミクログリアを用いた実験は、上記に加えてHMGB1などの自然免疫刺激物質刺激なども行って、その変化を解析する予定である。それにより、急性脳症の病態により近い実験モデルを選択できると考える。また、変化の指標として、サイトカイン以外にも、興奮性アミノ酸・酸化ストレスマーカー（8－OHDG）についても測定しミクログリアの多様な反応を解析する。サイトカイン・ケモカインはタンパク質多項目同時測定システム・マルチプレックスアッセイシステム（Merick Millipore 社）にて網羅的に測定する。8-OHDGの測定は市販のキットを用いて測定する。NOxはGriess反応、興奮性アミノ酸はウエスタンブロット法で測定する。また、それぞれのケミカルメディエーター遺伝子の発現を、定量的PCRを用いて解析する。MYRF遺伝子の関与する急性脳症も、発熱を契機に発症することが多い。MYRFの活性化を測定するルシフェラーゼアッセイを低温および高温下でおこない、変異MYRFの温度による機能変化を解析できるよう準備を進めている。
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| Causes of Carryover |
細胞分離培養および刺激実験、サイトカイン測定に用いた費用が予定を下回ったため、次年度使用額が生じた。次年度はグリア細胞を用いた研究を継続するとともに、急性脳炎・脳症症例に対する遺伝子解析と、急性期および平常時におけるサイトカイン解析を行うことで、過不足なく使用する計画である。
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