2017 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of chemo-resistant mechanism through DCK promotor demethylation and establishment of its prevention
| Project/Area Number |
17K10117
|
|---|
| Research Institution | Kagoshima University |
|---|
Principal Investigator |
岡本 康裕 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 准教授 (30398002)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | DCK / プロモーター / 脱メチル化 / ネララビン / 耐性 / 急性リンパ性白血病 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
DCKプロモーターの脱メチル化の誘導するために、以下の実験を行った。
培養による誘導 ①細胞株(CCRF-CEM)の培養において、低濃度(1μM)のネララビンを添加し、継代ごとにネララビン濃度を上げていった。3回の独立した培養のいずれにおいても7~10μMで細胞死が見られたが、一部の細胞は生存した。②クローニング：これらの生存した細胞を用いて、limited dilution assayを行った。1細胞では耐性を書くときした株を得られなかったが、5-10個の細胞からスタートした培養において、耐性株を2株得ることができた。これらの細胞は20μMでも生存した。この2細胞株を用いて、MTTアッセイを行ったところ、IC50は50-160μMであった。これらの細胞株を用いてまず、DCKプロモーターの脱メチル化以外の遺伝子異常が発生していないかについて、網羅的な遺伝子解析を実施した。1株において、WASH7P遺伝子の点変異を4箇所認めたが、これらはいずれもネララビン耐性に関連する異常とは考えられなかった。
さらに、この細胞株を選択し、次年度以降の研究に用いる。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
予定通り、ネララビン耐性細胞株を得られ、次のステップに進むことができる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
脱メチル化によるDCK 発現低下
DCK発現の低下があることをRT-PCR 法で確認する。① DCK発現の低下があると同時にネララビン代謝に関連するENT、CDA、RRM1 がフィードバック機構により発現調節が行われていることをRT-PCR 法で確認する。上記の結果として細胞内のara-GTP の低下をLC/MS 法で確認する。①DCKの発現低下とara-GTP の低下が相関することを確認する。薬剤感受性の低下をMTT アッセイで確認する。①DCKの発現低下と薬剤感受性の低下が相関することを確認する。②ara-GTPの低下と薬剤感受性の低下が相関することを確認する。
正常プロモーターによる表現型の救済
DCKの発現が低下した細胞株を用いて以下の実験を行う。プラスミッドベクターを用いて正常のDCK プロモーターで脱メチル化したプロモーターを置換する。①ベクターによって置換された細胞株をアンピシリンでクローニングする。クローニングされた細胞においてDCKの発現が回復していることをRT-PCR法確認する。この細胞株において細胞内のara-GTPの産生が回復していることをLS/MS で確認する。この細胞株においてネララビンに対する薬剤感受性が回復していることをMTT アッセイで確認する。②この細胞株においてara-GTP産生の回復と薬剤感受性の回復が相関することを確認する。
|
Research Products
(10 results)
