2017 Fiscal Year Research-status Report
デュシェンヌ型筋ジストロフィーiPS細胞を用いた心不全発症機序の解明と治療法開発
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17K10141
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
馬場 志郎 京都大学, 医学研究科, 助教 (60432382)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | デュシェンヌ型筋ジストロフィー / iPS細胞 / 心筋細胞 / 細胞死 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）患者iPS細胞（DMD-iPS）と両親から作成したコントロールiPS細胞（Control-iPS）から心筋分化させた。心筋分化はGiWiプロトコルとLactate methodを組み合わせることで各々の細胞株から80%以上の純度で心筋細胞が作成可能であった。各々の細胞サイズや形態に有意な差は認めなかった。細胞内のカルシウム濃度をIndo-1で測定すると、収縮期、拡張期いすれにおいても細胞内カルシウム濃度がDMD-iPS由来心筋細胞で高値であるだけでなく、収縮期・拡張期のカルシウム濃度の差もDMD-iPS由来心筋で大きかった。また、ストレッチチャンバーを用いた培養心筋細胞に対する機械刺激負荷において、Control-iPS由来心筋細胞に比べ、DMD-iPS細胞由来心筋で有意に細胞内カルシウム濃度が高くなるだけでなく、負荷前よりその有意差が顕著であった。また心筋細胞をイソプロテレノールで負荷したところ、DMD-iPS由来心筋細胞で有意に細胞数の低下を認めた。イソプロテレノール負荷を行ったDMD-iPS由来心筋細胞とControl-iPS由来心筋細胞をWST-8アッセイで比較すると有意にDMD-iPS由来心筋細胞で細胞活性低下を認めた。この細胞活性低下の原因究明のため細胞死について更に研究を行った。イソプロテレノール負荷後の心筋細胞をCaspase-3、TUNELで染色したが、DMD-iPS由来心筋細胞とControl-iPS由来心筋細胞で有意な差は認めなかった。GFP-mRFP-LC3をiPS由来心筋歳暮王にリポフェクションで導入しオートファゴソームの数を比較したところ、明らかにDMD-iPS由来心筋細胞で有意にオートファゴソーム数の増加を認めた。現在、オートファジーが起こる機序について研究継続中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究は概ね予定通り遂行可能であった。平成29年度内にDMD-iPS由来心筋細胞の細胞死を細胞内カルシウム濃度上昇の関係性を研究する予定であったが、本研究については現在進行中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
電子顕微鏡レベルにおいてもDMD-iPS由来心筋細胞内のオートファゴソーム出現について評価する。細胞内カルシウム濃度と細胞死の関連性を確認するため、電位依存性カルシウムチャネルブロッカーであるジルチアゼム、リアノジンレセプターブロッカーであるルテニウムレッド、ナトリウム /カルシウム交換系ブロッカーである KB-R7943、膜安定化作用により細胞内カルシウム濃度を安定化する Poloxamer p188などで細胞内カルシウム濃度をコントロールし、WST-8アッセイとオートファジーを評価するとともに細胞死抑制が可能であるか検討する。
以上のin vitroの実験結果を踏まえてmdxマウスを用いてin vivoでも実験を行う予定である。mdxマウスとコントロールマウス（C57/BL6）に対して皮下植え込み型薬剤持続投与カプセルを用いて持続イソプロテレノール心筋負荷を与え、組織学的に心筋細胞死増強が生じるか評価する。in vivoでの心筋細胞死については、心筋組織の心筋線維化面積を評価する。線維化はMasson-Trichrome染色で評価し、線維化面積は自動計算プログラムで評価する。また心機能については、mdxマウスとコントロールマウスに対して上記イソプロテレノール負荷を行い、負荷前後で心機能の評価を行う。in vivoにおいても同様に、細胞死がアポトーシス心筋細胞の細胞死について評価する。アポトーシスについてもTUNEL染色やAnnexinV染色による再評価を行う。オートファジーについては、オートファゴソーム数をカウントすることで評価する。mdxマウスの心筋細胞内カルシウム濃度が高値で心筋カルシウム過負荷が起こっている可能性については判明しているため、in vitro同様に、マウスへのカルシウム拮抗薬などの投与で心筋細胞のオートファジーが抑制されるか実験を行う。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由は、平成29年度に終了予定であった実験の一部が継続中であることが原因である。その研究内容は前述した以下の実験である。これらについては平成30年度に行う予定である。その実験内容は、電子顕微鏡レベルにおいてもDMD-iPS由来心筋細胞内のオートファゴソーム出現について評価すること、細胞内カルシウム濃度と細胞死の関連性を確認するため細胞内カルシウム濃度をコントロールし細胞死抑制が可能であるか検討することである。引き続き平成30年度に行う予定である。
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