炎症性腸疾患におけるDysbiosisと腸内細菌代謝産物が発癌に与える影響の解析

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K10627
• Research Institution: Hamamatsu University School of Medicine
• Principal Investigator: 倉地 清隆 浜松医科大学, 医学部, 助教 (20397384)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 今野 弘之 浜松医科大学, 医学部, 学長 (00138033) ; 山本 真義 浜松医科大学, 医学部, 助教 (70397420) ; 原田 岳 浜松医科大学, 医学部附属病院, 診療助教 (00537251) [Withdrawn]
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: CAC / 炎症性腸疾患 / 発癌 / 腸内細菌

Outline of Annual Research Achievements

Colitis-Associated Cancer(CAC)は，IBD患者の死因の約15%を占める最も重要な予後規定因子であり，CACの発癌予防がIBD患者の予後改善のための喫緊の課題である．CAC発癌は強い炎症を背景とするため様々なメカニズムが提唱されているものの，その詳細は未だ十分に解明されておらず，予防戦略も確立されていない．これまでの報告から，IBDの病態形成にはDysbiosisから起因する特異的な腸内細菌とその代謝産物が強く関与することが示唆されている．そこで本研究では，IBD切除症例のFFPEサンプルを用いて，NGSによる16SrRNAのメタゲノム解析を行い，腸内細菌叢を構成する細菌種の同定，構成比率の違いを明らかにする．癌を伴わないIBD症例とCAC症例の腸内細菌叢の構成成分の違いを潰瘍性大腸炎症例とクローン病それぞれで解析することにより，CAC症例にみられる特異的な細菌種の同定，および構成比率の変化を明らかにすることを目的として研究を行っている．　本年度は，昨年度に引き続き，臨床検体を用いたNGSによる16SrRNAの解析を試みている．当科において1990年以降に切除された潰瘍性大腸炎症例(約120例)，クローン病症例(約200例)，およびCAC症例(約20例)のFFPE標本からDNAを抽出し，高速シークエンス解析用アダプター配列を付加した16SrRNA領域特異的プライマー(V3-V4領域)を用いてPCR増幅，精製を行い，次世代シークエンサーに供するライブラリーを作製．高速シーケンス解析用アダプター配列を付加しPCR産物を用いて，次世代シーケンサーによる配列取得，および16SrRNAデータベースに対する相同性検索および系統分類解析を行っている．
さらに，上記次世代シークエンサーで得られた解析結果から，CAC症例に特異的にみられる細菌種の同定，および菌種組成の違いを明らかにすることを試みた．

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

過去の手術症例で当時の切除検体保存状態が悪い標本においてはDNAのクオリティが悪く，解析に時間がかかっており，目標症例数にまで達していない．また，途中経過での次世代シークエンサーのデータからは，癌を伴わないIBD症例とCAC症例の腸内細菌叢の構成成分の有意な相違が明らかとなっておらず，
CAC症例に特異的にみられる細菌種が同定されていない．

Strategy for Future Research Activity

DNA抽出方法は本年度より改良を行い，古いサンプルからもDNA採取が可能となってきている．
次世代シークエンサーによるメタゲノム解析では，現在のところ細菌叢に明らかな違いがみられていないが，まだ目標症例数に達していないためと考えている．十分な症例数での解析を行うことにより目的の細菌種の同定と原因メタボライトの同定が可能となる見込みである．