2017 Fiscal Year Research-status Report
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17K10960
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
川島 寛之 新潟大学, 医歯学系, 講師 (30361900)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
有泉 高志 新潟大学, 医歯学総合病院, 助教 (50571915)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 骨腫瘍 / 骨破壊 / RANKL / デノスマブ / 破骨細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
骨腫瘍における骨破壊の発生機序として、腫瘍組織で産生されるRANKL (receptor activator of nuclear factor-κB ligand: RANKリガンド) が非常に重要な役割を果たしていることが報告されている。すなわち、RANKLは破骨細胞の形成、機能、および生存を司る必須の因子であり、破骨細胞および破骨細胞前駆細胞に発現するRANKL受容体 (RANK) に結合し、破骨細胞による骨吸収を促進することで骨破壊を誘導するとされている。本年度は、溶骨性病変や骨破壊を呈している原発性および転移性骨腫瘍に対して抗RANKL抗体であるデノスマブを投与した症例について、臨床的に検討した。転移性骨腫瘍においては、原発巣別にデノスマブ投与後の骨硬化の出現について検討し、約7割の症例で骨硬化を認めたことがわかった。硬化を認めた症例においては、効果を認めなかった症例に比べて有意に骨関連事象の発現が少なかった。特に肺癌では、骨硬化の認められた症例において有意に骨関連事象の発生が少ないことがわかり、小細胞肺癌、EGFR遺伝変異、ALK融合遺伝子陽性肺癌では、全例で骨硬化が認められた。原発性骨腫瘍においては、デノスマブが治療薬として保険適応となってる骨巨細胞腫のほか、腫瘍組織内に破骨細胞様の多核巨細胞を伴う平滑筋肉腫においても、骨病変の硬化が認められることがわかった。また、同様に破骨細胞様の多核巨細胞を伴う動脈瘤様骨嚢腫や線維性骨異形成の組織におけるRANKLの発現を定量的RT-PCR法で検討し、いずれも乳癌骨転移組織に比べ高い発現を認め、骨巨細胞腫の組織と同等レベルの発現を認めることを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初計画した通り、凍結保存した骨腫瘍組織の臨床検体を用いてRANKLとその関連分子である、RANK, osteoprotegerinの発現を調べた。135例の臨床検体におけるRANKL, RANK, osteoprotegerinのmRNAの発現を定量的RT-PCR法で比較検討した。さらに、そのうち約半数においてはパラフィン包埋標本を用いて、RANKLの免疫組織染色を行い、タンパクレベルでの発現も検討した。RANKLの免疫組織染色の手法確立に時間を要したため、評価が不十分な部分があるが、現在遂行中である。凍結標本では、ウェスタンブロット法により、RANKL/RANKの上流シグナルであるIL-6やPTHrPなどのサイトカインの発現も検討している。IL-6についてはIL-6自己産生細胞株を所有しており、RANKLのオートクラインな産生についても検討を行っており、この部分については当初の予定以上の進捗状況と言える。IL-6とPTHrPに関しては、両者の遺伝子組み換えタンパク質を購入し、がん細胞の培養液に添加することにより、RANKL関連分子の発現の変化についても検討を進めており、この点も予定より進んでいると言える。ただし、IL-6やPTHrPの下流の細胞内シグナル伝達分子である、AKT, MAPK, STATなどの発現やそれぞれのリン酸化の有無などについては、まだ検討できていないため、予定より遅れている部分となっている。パラフィン包埋標本を用いた解析では、上記のようにRANKLの発現と破骨細胞のマーカーであるTRAPの発現については解析が進んでおり、予定通りと言える。しかし、骨芽細胞と軟骨細胞のマーカーであるALPやSOX-9の発現解析については、まだ行えていないため、予定より遅れている部分となっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまで、予定通りに進んでいない部分についてはより強力かつ迅速に研究を推し進めていく必要がある。腫瘍の凍結保存検体によるRANKL/RANKの発現とAKT, MAPK, STATなど細胞内シグナル伝達分子の発現とそのリン酸化の有無の解析については、抗体はすでに現有しており、ウェスタンブロット法の手技も確立しているため、大学院生や実験助手と共に検討を進める。Tissue Microarrayを用いたALPやSOX-9の染色に関しても、実験手技は確立しており、より時間をつぎ込んで研究を進めていく。これらの検討により、腫瘍組織内においてどのような性質を有する細胞がRANKL関連タンパクを発現しているのか同定を進める。さらに、30年度は培養細胞株を用いたin vitro実験も推し進めていく必要がある。IL-6やPTHrPの培養液への添加によるRANKL発現誘導に関する実験は、すでに予定以上に進んでいるところであるが、ここにはJAK-STAT3シグナルの関連が示唆される研究結果も出ている。これらの機序については、多くの数、種類の細胞株を用いて実験を行うことで、しっかりとした裏付けを取っていく。一方で、原発性骨腫瘍におけるオートクラインなRANKL発現の有無についてはまだ未検討であり、RANKL発現の高かった組織型から樹立された細胞株を用いることで、検討を進める。骨腫瘍細胞と骨髄細胞や破骨細胞との共培養によるRANKL発現の誘導の有無についても検討を進める。骨髄細胞や破骨細胞は株化細胞がなく、市販されている初代培養細胞キットを用いる必要があるが、高度な培養技術と、限られたタイミングでの実験が要求されると推測され、あらかじめ培養条件などの検討を進めておくことで、遅滞なく研究が進むと考えられる。
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