三次元培養皮膚におけるエクリン汗腺の再現

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K11542
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 亀田 健治 愛媛大学, 学術支援センター, 助教 (60363264)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 村上 正基 愛媛大学, 医学系研究科, 准教授 (20278302) ; 森 秀樹 愛媛大学, 医学系研究科, 講師 (60325389)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 三次元培養 / エクリン汗腺 / 皮膚再生医療

Outline of Annual Research Achievements

我々の研究目的は、皮膚再生医療を推進する三次元培養皮膚の作製法を改良することである。我々はこれまでに羊膜を併用して三次元培養皮膚を作製することで、簡便に三次元培養皮膚を作製できる方法を確立し報告している。培養皮膚の作製法はここ数年である程度の確立を認め、熱傷などに対する保険適応治療として、ベンチャー企業などからも患者角化細胞を用いた培養表皮が供給されるようになり、これによる自家移植が可能となった。しかしながら未だ三次元培養皮膚内での付属器の再生には至っておらず、今後マウスモデルに代わる実験モデルを目指す上で、表皮及び真皮内に付属器（汗腺、毛包、脂腺）を再現することは非常に重要な課題である。我々は三次元培養皮膚内にエクリン汗腺の構築（表皮内汗管、真皮内汗管、真皮内汗腺分泌部）を最終目的とする。
これまで、臨床検体からの真皮内導管細胞・腺房細胞の分離培養し、エクリン汗腺由来細胞の性質の検討をした。真皮内汗管細胞に対して増殖促進、抑制する因子の条件を検討し、エクリン汗腺由来細胞の増殖能、また、エクリン汗腺由来の他分化能について、現在検討中である。
我々はこれまで角化細胞の無血清培養法の開発、培養表皮シート自己移植の有効性の検討および保存液開発に伴うセンター化の確立を達成している。これら培養表皮シート移植法の開発と並行して、三次元培養皮膚作製法の確立、臨床応用における有用性の検討の結果、三次元培養皮膚は培養表皮シートと比較して生着性に優れていることを見いだしている。今回我々が提案するこの研究の最大の目的は、既存の培養法を使用して三次元培養皮膚を作製するのみならず、将来の基礎研究及び臨床応用に十分に貢献できる品質の三次元培養皮膚モデルの作製を目指すものである。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

我々は、皮膚再生医療を推進する目的のために三次元培養皮膚の作製法を改良することを目的とする。まず、二次元培養系においてNCL-SG3細胞による汗管（導管）構造への分化誘導を試みた。最適の増殖培養環境について培養液や添加因子、さらには培養条件を検討した。細胞成長因子の測定、サイトカイン、細胞成長因子刺激時の遺伝子発現などを指標とする。この結果を踏まえて臨床検体より得られたエクリン汗腺細胞を用いた同様の検討を行い、二次元培養系における汗管構造の構築を試みている。次に、二次元培養系での汗管構造の構築に成功したのち、LSE内（表皮内）での汗管構造構築を試みている。この時にNCL-SG3細胞及びエクリン汗腺細胞(真皮内導管細胞・腺房細胞)を用いて、I型コラーゲンゲル内に包埋培養を行い、これをLSE内に挿入し腺管形成の誘導を試みている。具体的には、
（１）エクリン汗腺由来細胞の増殖能の検討：
継代数を同じにしたNCL-SG3細胞、真皮内汗管細胞・腺房細胞を6ウェルプレートに同じ細胞数で播種し、培養4-7日後に細胞数を測定する。細胞数の測定結果をもって増殖能が高いか低いかを確認する。また、同じ継代数の細胞をシャーレに播種し、コンフルエントになった時点で継代を繰り返し、何回継代可能かについて検討することで長期的な細胞増殖能を推定する。
（２）エクリン汗腺由来の他分化能についての検討：
NCL-SG3細胞、真皮内汗管細胞・腺房細胞をそれぞれ培養し、分化誘導培地に変更しその形態的変化を解析する。具体的には、角化細胞誘導培地に変更後、上皮系マーカー(ケラチンなど)を免疫染色することにより角化について検討する。脂肪細胞誘導培地に変更後、脂肪染色にて陽性細胞が得られるかについて検討する。骨分化誘導培地に変更し、アルカリフォスファターゼ染色陽性の骨細胞へ分化する能力を維持しているか検討する

Strategy for Future Research Activity

平成３０年度までに検討不十分な事項について再検討しつつ研究を遂行する。
（１）臨床検体からの真皮内導管細胞・腺房細胞の分離培養について最適条件かどうか再検討する。（２）エクリン汗腺由来細胞の性質の再検討する。具体的には、サイトカイン・細胞成長因子刺激後経時的にRNAを回収し、主にサイトカイン・細胞成長因子の遺伝子発現についてmicro array解析、real-time PCR法にて比較検討する。（３）エクリン汗腺由来細胞の増殖能の再検討する。具体的には、継代数を同じにしたNCL-SG3細胞、真皮内汗管細胞・腺房細胞を細胞数の測定結果をもって増殖能が高いかを再確認する。（４）エクリン汗腺由来の他分化能についての検討する。具体的には、NCL-SG3細胞、真皮内汗管細胞・腺房細胞をそれぞれ培養し、分化誘導培地に変更しその形態的変化を再解析する。角化細胞誘導培地に変更後、上皮系マーカー(ケラチンなど)を免疫染色することにより角化についも再検討する。

Causes of Carryover

（１）エクリン汗腺由来細胞の培養に必要な培養液（２）培養上清中のサイトカイン・細胞成長因子についてELISA法に必要な試薬（３）サイトカイン・細胞成長因子の遺伝子発現についてmicro array解析、real-time PCR法に必要な消耗品などが、条件設定のために必要であるため、生じた額は、次年度必要となる。