三次元培養皮膚におけるエクリン汗腺の再現

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K11542
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 亀田 健治 愛媛大学, 学術支援センター, 助教 (60363264)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 村上 正基 愛媛大学, 医学系研究科, 准教授 (20278302) ; 森 秀樹 愛媛大学, 医学系研究科, 講師 (60325389)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 三次元皮膚培養 / エクリン汗腺 / 再生医療

Outline of Annual Research Achievements

今まで表皮角化細胞の生物学、培養方法などについて研究を行ってきた。その結果、表皮角化細胞の無血清培養法を確立し、動物由来材料を用いない培養法を開発することに成功した。さらにこの培養法を用いた培養表皮シートを作製、実際に臨床応用を行い良好な成績を示すことに成功している。しかし、培養表皮のシートは組織学的検索の結果、1角層を有しない、2基底膜の構成成分をほとんど有しない、3付属器の形成を認めないことが明らかとなり、培養表皮シートは創傷治癒促進の効果は優れているが、生着性に問題があることが明らかとなった。
表皮の主たる機能は角化であり、正常角層を作ることが皮膚角化細胞の最終目的である。角層を有する培養皮膚として三次元培養皮膚が開発されているが、臨床応用は予想外に遅れている。この原因としては、その作製方法が複雑であることと、大量作製が困難であることなどが挙げられる。この点を改良すべく表皮細胞と羊膜を応用することにより、簡便かつ大量に三次元培養皮膚が作製可能な方法を開発した (J Dermatol Sci 2009) 。三次元培養皮膚では真皮に相当する部分にコラーゲンゲルを用いることが多いが、コラーゲンゲルを使用しなければならないために、作製過程が複雑にならざるをえない。そこで我々は真皮成分に相当する材料として羊膜に着目し、簡便な三次元培養皮膚の作製が可能であることを明らかにした。
今や三次元培養皮膚の製作手技はある程度の確立を認め、すでに商業ベースからの入手も可能となった。しかしながら現時点で、付属器を含有する正常皮膚を模倣するような三次元培養皮膚を確立した施設は見受けられない。今回我々は、エクリン汗腺の構造を有する三次元培養皮膚の新規作成方法の開発を目指すため、この研究を立案した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

昨年度、エクリン汗腺由来細胞による表皮内汗管への分化誘導を中心に実験を行なった。すなわち、分離培養された真皮内汗管細胞・腺房細胞を長期間培養し、その培養条件を適切な時期に変更し、さらに細胞成長因子などを添加する方法や、conditioned mediumを用いる方法、さらには角化細胞あるいは線維芽細胞との供培養の系を用いることで表皮内汗管、真皮内汗管へ分化誘導する系を試みた。しかし、まだ、分化誘導が再現性良く行なえていない。今後、更に、条件を検討する必要がある。
胎性幹細胞からの角化細胞への誘導についても、まだ、誘導が充分ではないので、FAD培地にて培養し、その後BMPとアスコルビン酸添加することによりケラチン陽性細胞を誘導する検討が必要である。さらに角化細胞用培地に変更し角化細胞の増殖を高め、継代することにより間葉系細胞の割合を減らしていく方法で、エクリン汗腺由来細胞を培養し、BMPの添加時期と添加濃度を数種類の組み合わせで試すことにより最適な条件を再検討を要すると思われる。

Strategy for Future Research Activity

エクリン汗腺由来細胞による表皮内汗管への分化誘導と胎性幹細胞からの角化細胞への誘導は、再検討する必要がある。conditioned mediumを用いる方法、角化細胞あるいは線維芽細胞との供培養の系を用いることで分化誘導する系を検討する。また、供培養系を用いた誘導を行い、シャーレ底面にエクリン汗腺由来細胞を播種し、インサートに線維芽細胞を播種し供培養する。培養液は角化細胞様培地と線維芽細胞用培地をためし、さらに１：１で混合した培地も試す。数週間培養を続け、形態学的に汗腺細胞のコロニーが出現するか確認する。コロニーが出現すればCEA、GDCFP-15など汗腺マーカーが陽性となっているか確認し、前記方法にて継代する。
次に、分化誘導したエクリン汗腺組織を用いた三次元培養表皮の作製を行なう。ブタ腱由来Ⅰ型コラーゲン液に脂肪由来間葉系幹細胞を加えてカルチャーインサートに添加し、ゲル化させる。その後10%FCS/DMEMを適量インサートの内と外に添加し、５日間5%CO2, 37℃で培養する。５日後にゲルが収縮しているか確認する。ゲルの表面にあらかじめ培養しておいた汗管コロニー形成のみられるエクリン汗腺由来細胞を表皮角化細胞と共培養として播種する。３日間培養後、空気曝露を行い重層化させる。経時的にサンプルを回収し、HE染色、免疫染色、電子顕微鏡にて検索する。正常な表皮及び表皮内汗管が構築されていれば、経時的にサンプルを回収し、HE染色、免疫染色、電子顕微鏡にて検索する。具体的にはHE染色にて形態学的な特徴を解析し、免疫染色にて基底膜構成成分、細胞間接着因子、細胞骨格(keratin 5, 14, 10)、分化マーカー(involucrin, loricrin, transglutaminase)、汗腺マーカー(CEA, GDCFP-15)などの発現を比較する。

Causes of Carryover

昨年度は、新型コロナウイルスの影響により、研究が予想以上に進まなかった。再度、エクリン汗腺由来細胞のゲル内での真皮内汗管への分化誘導の検討と分化誘導したエクリン汗腺組織を用いた三次元培養表皮の作製について再検討する。