2018 Fiscal Year Research-status Report

チロシンキナーゼ阻害分子 Sprouty による口腔癌リンパ節転移制御機構の解明

Research Project

Project/Area Number	17K11692
Research Institution	Kurume University
Principal Investigator	武富孝治久留米大学, 医学部, 講師 (10553290)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	讃井彰一九州大学, 大学病院, 講師 (70507780) 福田隆男九州大学, 大学病院, 講師 (80507781)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	Smad 経路
Outline of Annual Research Achievements	昨年度は、扁平上皮細胞株における Sprouty ファミリーの発現を RT-PCR で確認したことから、本年度は、口腔癌とくに扁平上皮癌における Sprouty ファミリーの発現について免疫染色法をもちいたタンパク質レベルでの発現を行った。組織学的に扁平上皮癌は分化度によって分類されるため、今回は大きく分けて高分化・高分化以外（中等度～低分化）での発現を調べることとした。もともと Sprouty ファミリーはユビキタスに発現しているため、予備実験で別の腫瘍細胞の切片を用いて染色を行い、希釈条件などいくつか代えてみたり、オートクレーブ処理での抗原賦活化などを試みたが、条件の良い染色結果は得られなかった。今後、in situ ハイブリダイゼーションなどでの対応を考える必要がある。一方、 ERK1/2 経路とは異なる Smad 経路における Sprouty の制御機構が、マウスの細胞を用いて解析されているがヒトの細胞では解明されていない。癌細胞の転移において EMT (Epithelial-Mesenchymal Transition: 上皮間質転換) が関係していることは広く知られており、この EMT にも深く関与する Smad 経路の制御機構を解明するため Sprouty2をヒトの株化細胞に強制発現させ、ヒトの細胞においても Smad の活性化を抑制することが分かった。現在、この本研究の過程で得られた結果を早期に発表すべく、論文を作成中である。また、癌細胞が分泌するエクソソームや microRNA が転移機構に影響している可能性を鑑み、解析を進めている。さらに、扁平上皮癌が分泌する IL-8 が血管新生を誘導することが知られており、これがリンパ管新生にも関わっているかどうかを解析し、Sprouty ファミリーがその産生に影響していないか解析を行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 本年度はまず、免疫染色における条件設定に時間を費やしたことで、遅れが生じてしまった。また、これまで MAPK 経路においてその制御に関与する Sprouty が癌の増殖・転移に関わる TGF-β スーパーファミリーのシグナル伝達経路の制御にも関与することを示した解析結果において、ヒトの細胞での解析が発表されていないため、そのデータの収集と論文作成に時間をかけたため、遅れが生じた。
Strategy for Future Research Activity	まず、Sprouty ファミリーの免疫染色に使用する抗体であるが、なかなか特異的に染色されるものが見いだせなかったため、RNA レベルでの検出にして、 in situ ハイブリダイゼーションでの発現解析を考えている。ただ、保存してある切片はパラフィン切片で、通常 ISH で用いる切片としては、凍結切片であることが多い。そのため、パラフィン切片で ISH を行う手法を調べたところ、受託研究で行っている会社があることから、そちらでの解析が可能か否かを費用も含めて交渉することとしている。また、本研究の過程で得られた、ヒトの株化細胞における Smad 経路の制御機構はその先駆的内容から論文発表意義が高いことから、早期に論文発表して実験系のみに力を注げるようにする。
Causes of Carryover	本年度は組織切片の染色など、もともと研究室に存在している試薬などを用いることで染色を行うことができた。しかしながら組織切片での解析において、Sprouty ファミリーの抗体は効率的なものがなく、ISH をパラフィン切片で行う技術を有している会社への受託研究を考えている。本研究の過程で得られた結果に関して、論文発表することにより、今後の先駆的研究として評価される可能性を鑑み、オープンアクセスジャーナルへの投稿準備を行っている。オープンアクセスジャーナルは、その雑誌により掲載費用も様々であることから、今年度研究費を節約した分を以て、追加実験や投稿費に充てる予定である。また、当初予定にはなかったサイトカインとエクソソームが転移に関わっているとする実験解析にもう少し費用をかける必要が出てきたと判断したため、その解析にも費用を充てる計画を組んだ。