骨形成作用を有する抗DKK-1抗体の効果メカニズムの解明

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K11753
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 井上 美穂 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学系), 助教 (20271059)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 井上 正久 徳島文理大学, 薬学部, 教授 (20223274) ; 宮城 麻友 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学系), 助教 (20625719) ; 松香 芳三 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学系), 教授 (90243477)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 抗DKK-1抗体 / TNF-α / 骨粗しょう症モデルマウス / 顎骨壊死

Outline of Annual Research Achievements

抗DKK-1抗体の効果メカニズムを解明することで、新たな骨粗鬆症治療薬、骨形成、骨補填剤としての可能性を探索する。骨代謝に関連するWnt/βカテニンシグナルは、骨細胞、骨芽細胞から産生されるDKK1により阻害され、骨芽細胞の分化抑制、破骨細胞の形成促進が報告されている。抗DKK-1抗体はWnt/βカテニンシグナルを阻害しないため、骨形成作用を有すると考えられる。しかしながら、抗DKK-1抗体の骨髄でのメカニズムについてはあまり知られていないのが現状である。
本年度は、マウス長管骨の骨髄から分離培養した骨髄細胞を用いて、細胞増殖能、分化能を検討した。細胞増殖能においては、MTSアッセイにて検討し、抗DKK-1抗体投与群、TNF-α投与群、抗DKK-1抗体＋TNF-α投与群、コントロール群において、有意な差は認められなかった。細胞分化能においては、アルカリフォスファターゼ活性について検討したところ、抗DKK-1抗体投与群はコントロール群と差は認められなかったが、TNF-α投与群、抗DKK-1抗体＋TNF-α投与群においては、活性が抑制される傾向にあり、TNF-α投与によって分化が抑えられることが示唆された。今後は、骨髄培養細胞からRNAを抽出し、定量性RT－PCR法を用いて、炎症性サイトカイン、幹細胞化の指標となる遺伝子についても検討する。
現在、動物実験もスタートし、8週齢C3Hマウスの卵巣を摘出し、骨粗しょう症モデルマウスを作製している。今後、抗DKK-1抗体を投与し、抜歯後の顎骨壊死が起こるかどうかについて、マイクロCT等を用いて検討する予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は、マウス長管骨の骨髄から分離培養した骨髄細胞を用いて、細胞増殖能、分化能を検討した。細胞増殖能においては、MTSアッセイ、細胞分化能においては、アルカリフォスファターゼ活性を検討した。　現在、動物実験もスタートし、8週齢C3Hマウスの卵巣を摘出し、骨粗しょう症モデルマウスを作製している。

Strategy for Future Research Activity

今後は、in vitro研究では、骨髄培養細胞からRNAを抽出し、定量性RT－PCR法を用いて、炎症性サイトカイン、幹細胞化の指標となる遺伝子についても検討する。さらに、FACSを用いて、実際の細胞がどのくらいの割合で幹細胞になっているかの確認を行う。さらに、シグナル伝達経路の検討として、TNF-αを作用させた際のシグナル伝達経路について、タンパク質リン酸化の検討として、ウエスタンブロッティング、ELISA、リン酸化タンパク質/リン酸化ペプチドの濃縮、キナーゼ活性アッセイを行う。
また、動物実験もスタートし、骨粗しょう症モデルマウスを用いて、抗DKK-1抗体を投与し、抜歯後の顎骨壊死が起こるかどうかについて、マイクロCT等を用いて検討する予定である。その後、マウスの顎骨を取り出し、パラフィン包埋後、HE染色、免疫組織化学染色により、シグナル伝達経路の検討を行う。

Causes of Carryover

平成29年度は海外での発表を予定していたが、日程が合わず、断念したため、旅費の予算が変わってしまったため、次年度への繰り越しとなった。今年度は、海外での学会出張、論文投稿などが予定されている。