2017 Fiscal Year Research-status Report
Myocardial protection via mTOR - Proposal of novel therapy for ischemia-reperfusion injury
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17K11909
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
北畑 洋 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学系), 教授 (60161486)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高石 和美 徳島大学, 病院, 講師 (20325286)
川人 伸次 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学系), 特任教授 (60284296)
堤 保夫 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学系), 准教授 (90523499)
藤原 茂樹 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学系), 助教 (90434505)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 心筋保護 / 虚血再灌流 / mTOR / rapamycin / ロイシン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
心血管疾患は生活習慣の変化に伴い近年急増しており，特に糖尿病を基礎疾患にもつ患者は発症率が高い。申請者らはこれまでに，アミノ酸投与が心筋梗塞サイズを減少させ，予防的に心保護作用を示すことを動物モデルにおいて明らかにした。そこで本研究では，アミノ酸，特にロイシンに応答するmammalian target of rapamycin（mTOR）に注目し，ロイシンの心筋保護経路にmTORがどのように影響するかを検討した。
摘出心をランゲンドルフ酵素法にて灌流，得られた遊離心室筋細胞をディッシュに接着させたのち，通常培養液を「グルコースなし」のものに置き換え，特殊チャンバーを用い，1時間低酸素状況 (95%N2, 5%CO2) に曝露することで心室筋細胞に虚血状態をつくりだした。その後1時間通常の培養状態に戻すことで再灌流状態とした。細胞をトリパンブルー染色することで死亡細胞と正常細胞を区別し，生存率を割り出した結果，ロイシンであらかじめ2時間刺激を与えた場合，心筋細胞保護効果が認められた。mTOR inhibitorであるrapamycin，PI3K inhibitorであるwortmanninを用いて同様の実験を行うと，rapamycinは心筋保護作用が棄却されたが，wortmanninを加えてもロイシンの心筋保護作用は有意に変化することはなかった。これらのことより，ロイシンの心筋保護作用にmTORの経路が影響していることが示唆された。
次に，ロイシン刺激の細胞に対しイムノブロットを用いてシグナル経路の活性化を調べた結果，ロイシンはインスリン受容体シグナルの下流シグナルには影響を与えることはなかったが，mTORやS6Kなどのシグナル活性を誘発することが明らかとなった。
さらに現在，低酸素灌流モデルを用いてミトコンドリア機能についての研究を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
In vitro遊離心筋細胞を用い，低酸素モデルにて心筋細胞死亡率がロイシン刺激により低下することが明らかになった。また，これらのシグナルメカニズムについて各種ブロッカーを用いた実験で，ロイシンの心筋保護作用にmTORの経路が影響していることが示唆された。さらにロイシンはインスリン受容体シグナルの下流シグナルには影響を与えることはなかったが，mTORのシグナル活性を誘発することが明らかとなった。以上のように研究実施計画の平成29年度【実験1】がプロトコール通り順調に進んでおり，現在【実験2】にとりかかっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続きロイシンの心筋保護作用に対するミトコンドリア機能の影響についての研究を続け，実験1．の低酸素再灌流モデルにて，ミトコンドリア染色色素（MitoTracker），光褪色後蛍光回復法（FRAP assay）を用いてロイシンによるミトコンドリアダイナミックス（ミトコンドリアの分裂と融合）を明らかにする。分裂・融合タンパクについてイムノブロット・real-time PCRを用いて調べることで，ミトコンドリアの融合タンパクであるOpa-1が有意に増加することを明らかにする。Opa-1 siRNAを電気穿孔法にて細胞に注入，トランスフェクションさせた細胞を用い，ロイシンの心筋保護作用が棄却するかを調べる予定である。
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| Causes of Carryover |
（理由）
ランゲンドルフ酵素法にて得られた遊離心室筋細胞を用いた虚血再灌流実験で，コントロール群およびロイシン群ともに結果のばらつきが予想よりも少なく，予定していたn数よりも少なく終了したため研究費の残額が生じた。この費用は，次年度のミトコンドリアダイナミックスを明らかにする実験2の試薬等の購入に充てる。
（計画）
低酸素再灌流モデルにて，ミトコンドリア染色色素（MitoTracker），光褪色後蛍光回復法（FRAP assay）を用いてロイシンによるミトコンドリアダイナミックス（ミトコンドリアの分裂と融合）を明らかにする。分裂・融合タンパクについてイムノブロット・real-time PCRを用いて調べることで，ミトコンドリアの融合タンパクであるOpa-1が有意に増加することを明らかにする。また，ミトコンドリア膜電位をJC-1 assayにて蛍光検出し，ロイシンが与える影響について考察を加える。
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