2018 Fiscal Year Research-status Report
Apert症候群に対する疾患特異的iPS細胞の樹立とその応用
| Project/Area Number |
17K11948
|
|---|
| Research Institution | Tokyo Dental College |
|---|
Principal Investigator |
石井 武展 東京歯科大学, 歯学部, 講師 (80433978)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山口 朗 東京歯科大学, 歯学部, 客員教授 (00142430)
末石 研二 東京歯科大学, 歯学部, 教授 (00154427)
小野寺 晶子 東京歯科大学, 歯学部, 講師 (90637662)
齋藤 暁子 東京歯科大学, 歯学部, 助教 (90722835)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | Apert症候群 / iPS細胞 / FGFR2 / Gain of function |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
頭蓋顎顔面に変形をきたす遺伝性疾患は、頭蓋顎顔面の健常者と異なる成長様式を示し頭蓋 顎顔面領域の醜形を惹起する。また、頭蓋顎顔面形態の異常は、脳神経や気道など生命維持に必要な器官への影響が強く治療が難しい。その中でも、Apert症候群は、線維芽細胞成長因子受容体（以後FGFR2）の変異が報告されており、IgIIドメインの変異Ser252Trpが2/3, IgIII
ドメインの変異Pro253Argが1/3に認められる。これらはGain of functionの病態を示す。
FGFR２は特に骨や軟骨形成に関与していることが示されておりFGFR2が上記の部位で点変異すると通常では結合しないFGFがFGFR2に結合することにより、細胞内にシグナルを入れることが判明している。臨床所見として、15万人に1人の割合で出生し、早期頭蓋の癒合、口蓋裂、癒合指、気道閉塞、ファロー四徴症および精神遅滞を伴い、生後1歳から10回以上もの外科的な処置が必要な重篤な難病である。Apert症候群の臨床上の問題点として、生命予後を脅かすような外科的な治療が主となっており非侵襲的な治療が不可避である。本邦では国の指定難病とされており文部科学省と厚生労働省より速やかな疾患発症機序の解明、創薬研究および治療法の開発が推進されている疾患の一つである。
近年、マウスモデルの作製による本疾患の病態解明が報告されているが、ヒト由来の疾患モデルは未だ作製されておらず、本疾患の病態は不明な部分が多い。そこで、当院矯正歯科に来院しているApert症候群の患者の口腔粘膜上皮または血中リンパ球より、疾患特異的iPS細胞の樹立を行い、この細胞から骨あるいは軟骨への分化異常機序の解明、および正常FGFR2を導
入したiPS細胞による正常骨分化誘導を確認することによりApert症候群の発症機序の解明を行う。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
現在FGFR2の変異部位を正常化したiPS細胞と変異をホモに持つiPS細胞をCrisper-cas systemを用いて作成している。当初オフターゲット効果を低減する目的でダブルニッキング法を用いエレクトロポレーションにより導入した、60コロニーを回収しシークエンスを確認したが目的の遺伝子の導入が確認できなかった。そこでシングルニッキング法に変更し再びエレクトロポレーションを行い50コロニーを回収、確認したが導入が認められなかった。そこでgRNAの設定部位の変更を行うことを検討している。従って、コントロールの作成に時間がかかり進捗が遅延しているが、Apert症候群由来細胞を用いて解析は行なっているため、病態解明には影響が少ないと考える。
|
| Strategy for Future Research Activity |
現在はNips-B2 (HPS0223)をコントロールとして用いてApert症候群のiPS細胞を骨芽細胞分化誘導し表現型を確認している。また、Nips-B2 (HPS0223)をコントロールとして用いてApert症候群のiPS細胞に対して軟骨分化誘導を行い軟骨細胞の浮遊培養によるパーティクル作製まで完了した。これらの細胞を用いて、Apert症候群のFGFR2変異によるFGFsの非特異的結合実験を行い、FGFファミリーのうちどのFGFがApert症候群において最もシグナルを入れるかをPull down assayなどにより確認予定である。加えて、FDFR2下流のシグナルについて検討を行い、どの部分で抑制すれば正常に近づけることができるか新規創薬の点からも検討を行う予定である。遺伝子編集したiPS細胞が樹立でき次第それぞれを骨芽細胞分化誘導および軟骨分化誘導を用いて、疾患iPS細胞と正常化iPS細胞の反応の違いについて機能解析を行うことで明確にしていく予定である。
|
| Causes of Carryover |
本研究をまとめるにあたり最終段階で遺伝子編集細胞を用いて、Apert症候群の新規治療法の検索のためキナーゼインヒビターライブラリーを用いた検索を行う予定であるが、高額なため多少予算を繰り越して最後のまとめの際に不足がないようにしているため。
|
