2017 Fiscal Year Research-status Report
Involvement of resident oral microorganisms in the pathophysiology and degree of progression of valvular heart disease
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17K12019
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| Research Institution | Showa University |
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Principal Investigator |
葭葉 清香 昭和大学, 歯学部, 講師 (60555358)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鎌谷 宇明 昭和大学, 歯学部, 准教授 (00315003)
椋代 義樹 昭和大学, 歯学部, 助教 (50325099)
栗原 祐史 昭和大学, 歯学部, 助教 (90514969)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 心臓弁膜症 / 口腔内細菌 / クローナリティー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
口腔内常在菌は、未同定の細菌を含め約700種類、1000億個以上あると言われており、そのほとんどが数種類のレンサ球菌属で占められている。これらの口腔細菌は、口腔内で病原性を発揮するだけではなく、抜歯等の観血的な処置によって血液中に侵入することが知られている。菌血症は、健常者では一過性であるが、ある種の心疾患を有する対象では心臓の弁膜や心内膜に血小板やフィブリンと細菌の塊を形成し、感染性心内膜炎の発症につながることがある。一方で、菌血症は侵襲的な処置だけではなく、日常の口腔清掃によっても度々生じている可能性があるとされており、口腔細菌の血液中への侵入は、一般に考えられているよりも高頻度であることが想定される。このことは、口腔細菌が血流を介して様々な組織や臓器に到達し、これまでに解明されていない影響を及ぼしている可能性を示唆している。近年、口腔内細菌と糖尿病、誤嚥性肺炎、低体重児出産、早産、関節リウマチなどの全身疾患との関連に焦点が当てられており、口腔細菌の及ぼす各種全身疾患への影響が注目されている(仲野和彦，小児歯科臨床, 2009.)。
口腔内常在菌や細菌由来の内毒素が血管内に入り込むと、菌体やその成分による直接的な傷害作用やサイトカイン産生、免疫担当細胞の応答へ影響を及ぼし、全身の各種疾患の進行に関与すると報告されている。既に口腔内常在菌が糖尿病、誤嚥性肺炎、低体重児出産、早産、関節リウマチなどの全身疾患と関連があることが近年の研究で明らかにされつつあるが、遺伝子解析によるクローナリティーを証明した報告は少ない。
本研究では、心臓弁膜症患者における手術時の摘出弁組織と口腔内・血中から検出された菌が同一クローンであるかの検討を行い、口腔内常在菌の心臓弁膜症の病態・進行度・病理組織学的因子への関与を明らかにし、周術期における口腔内管理の有効性を検証することを目的とする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成２９年度は、口腔内プラーク、心臓弁組織からのDNA抽出法について検討し、抽出方法を確立した。回収された臨床検体については順次、DNA抽出し、PCR解析を行う準備を行っている。また、免疫組織学的に検討する組織については、パラフィンブロックに包埋し、HE染色、免疫染色を行う準備を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成３０年度については、心臓弁検体より採取したDNAをBroad-range PCR 法を用いて 16S rRNA 遺伝子の配列を検索する。種々の細菌に共通な 16S rRNAの保存領域にプライマー(大楠ら、日本微生物学会雑誌14：1-13)を設定し PCR を施行する.これらのプライマーで増幅される遺伝子断片は 16S rRNA をコードする遺伝子のほぼ全領域（1,500bp）を含んでおり、これらの遺伝子断片の配列を決定し、可変領域の配列を比較することによりクローンを同定する予定である。
また、得られた PCR 産物を精製し、テンプレートとして遺伝子断片の増幅に用いたのと同一のプライマーをシークエンシングプライマーとして用い、BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit （ABI 日本）を用いて反応を行なう。Applied Biosystems 3130xl ジェネティックアナライザー（ABI 日本）にてキャピラリー電気泳動を行うことにより塩基配列を決定し、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）による相同性検索を行う予定となっている。
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| Causes of Carryover |
本年度は、臨床検体からのDNA抽出手技の確立が主な研究内容となっており、実験試薬や機材の購入が予想よりも低価格で済ませることが可能であった。平成30年度にかけて、順次採取された臨床検体からDNAを採取する必要があることと、PCR解析やシークエンス解析を行う予定であるため、使用額については、当初予定通りの使用額になることが予想される。
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