2017 Fiscal Year Research-status Report
結合型アスパラギン酸異性化は老化の新たな指標となりうるか？
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17K13221
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
高田 匠 京都大学, 原子炉実験所, 特定准教授 (80379007)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | D-アミノ酸 / 白内障 / タンパク質異常凝集 / クリスタリン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近代生命科学のトピックの一つとして、加齢後の生体内タンパク質中において新しく見出されてきた構成要素、D型アミノ酸の存在を挙げる。これは、生体内タンパク質を構成するアミノ酸残基中、グリシンを除くアミノ酸全てに鏡像異性体が存在しうるという事実を指す。アミノ酸の中でも、特有の異性化機構を有するアスパラギン酸残基(Asp: L-α-Asp)は生体内条件下でD-Asp化が顕著に進行し、加齢に応じ生体内に蓄積する。この際、同時にL-β-Asp, D-α-Asp, D-β-Aspへとそれぞれ異性化は進行し、L-α-Aspと合わせて計4種類の形態をとる。おそらく、通常のタンパク質中に異常型であるD-Aspなどが蓄積することで、タンパク質構造の局所的変化が起こり、タンパク質機能不全が生じると予想される。しかしながら、これまで加齢性疾患とD型アミノ酸との相関性が示唆されている一方、その相関性を裏付ける実験的証拠は存在しない。実験的な裏付けが進行しない原因は、D型アミノ酸を導入したタンパク質を生合成する技術が存在しない点にある。本研究では、加齢後ヒト眼球内の水晶体組織に着目し、その主要構成タンパク質クリスタリン中において、加齢依存的に増加するAsp異性化部位の同定に取り組んだ。加えて、異性化同定部位のAspを種々の他アミノ酸に置換したリコンビナントクリスタリンを大腸菌を用いて作成し、野生型との比較を行った。その結果、該当Asp部位(Asp58)の化学的性質変化（疎水性の変化）がクリスタリン凝集を引き起こすことが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
各年代(7歳~84歳)の加齢性ヒト水晶体より抽出した巨大分子量凝集体内に含まれるαA-クリスタリン中を単離して、新たに開発したD/L分析手法へと用いた。その結果、αA-クリスタリン中のAsp58異性化が年齢依存的に増加していることが判明した。加えて、別クリスタリンサブユニット(βB2-クリスタリン)中においても異性化 Asp部位を見出している(Takata T et al.(2018) BBA. in press)。
Asp58に関してはαA-クリスタリン中のN末端側領域部分に存在することから、本Asp異性化が、クリスタリン分子間の相互作用へと影響を及ぼすことが予想された。これを証明するべく、種々の変異を導入したαA-クリスタリンを作成し、生化学的解析へと用いた。その結果、Asp58部位の疎水性変化がαA-クリスタリンの凝集サイズに影響を及ぼすことが明らかとなった(Takata T et al.(2018) FEBS J. in press)。したがって、現段階で本研究は、概ね順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
実際のタンパク質中にAsp異性化が生じた場合に、生体に及ぼされる影響を証明するためのフィードバック実験は必須である。しかし、同実験は極めて困難である。なぜなら、現在までAsp異性体を人為的にタンパク質内へ導入する手法が存在しないためである。この難問に対する今後の研究方策として、我々は発現タンパク質ライゲーション(以下、EPL法)を用いた研究を進めてゆく予定である。まずは本年度に見られたαA-クリスタリン中のAsp 異性化部位を標的として、該当Aspを異性化Aspに置換したD型アミノ酸含有αA-クリスタリンを作成し、生化学的解析へと用いる予定である。
得られた成果から水晶体中におけるクリスタリン中のD-Asp形成が有する生理的意義を推測し、Asp異性化が、どのように加齢性白内障の発症と関わるのかを明らかにする。
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