Development of functional nucleic acid whose activity is altered between inside and outside the cell by utilizing in-cell NMR

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K14515
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 山置 佑大 京都大学, エネルギー理工学研究所, 研究員 (00778095)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 四重鎖核酸 / in-cell NMR / リボザイム / アプタマー / カリウムイオン

Outline of Annual Research Achievements

GGA繰り返し配列を有するRNAがカリウムイオン(K+)存在下でグアニン四重鎖と呼ばれるコンパクトな構造を形成することを利用し、K+依存的にハンマーヘッド型リボザイムの活性をオン／オフ可能な四重鎖リボザイム(QHR)およびHIVウイルスのTatタンパク質を捕捉するRNAアプタマーの活性をオン／オフ可能な四重鎖Tat捕捉アプタマー(QTAp)を開発した。生体内においては細胞外K+濃度が低い(約5 mM)のに対し、細胞内K+濃度は高く(約100 mM)保たれている。そのため、QHRやQTApのようなK+応答性の機能性核酸は自身が細胞内および細胞外のいずれに存在しているのかを感知し、自らの活性をスイッチする新規の機能性核酸と成り得る。
平成30年度は、QHRやQTApなどの機能性核酸が実際の生細胞内において、意図した構造を形成可能か評価するために、in-cell NMR法による細胞内核酸の構造安定性評価手法の確立を行った。細胞膜上に可逆的に細孔を形成する毒素タンパク質SLOを用いて核酸を細胞内へ導入し、ヒト生細胞内に存在する核酸のNMRスペクトルを測定した。この際、水のプロトンだけを選択的に励起し、この水と核酸のイミノプロトンの交換速度を解析した。イミノプロトンは安定な塩基対中では水との交換が抑えられ、不安定な塩基対中では容易に水と交換するそのため、プロトンの交換速度は核酸構造の安定性を評価する指標となる。交換速度解析の結果、細胞内においてはワトソン－クリック塩基対からなるRNAのヘアピン構造が、試験管内の希薄溶液条件下よりも不安定化していた。これはQHRやQTApについても細胞内ではステム構造が不安定化する可能性を示唆しており、細胞内で働く機能性核酸の新たな物性評価方法を示した。以上の成果は国内および国際会議において報告した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

予定通り、in-cell NMR法を用いて細胞内の核酸の構造安定性を評価する手法の確立を行った。ヒト生細胞内での核酸の構造安定性評価のためには長時間のin-cell NMR測定が必要であるが、通常のin-cell NMR測定では細胞試料が経時的に劣化し、スペクトルを安定に得ることが困難であった。そこで長時間の測定を可能にするため、in-cell NMRスペクトル測定中も常に新鮮な培地を細胞試料に送液可能なバイオリアクターシステムを導入した。これにより十分な測定時間を確保することに成功した。
バイオリアクターシステムを用いたin-cell NMR測定により、核酸構造の安定性を評価する指標となる水のプロトンと核酸のイミノプロトンの交換速度をヒト生細胞内で測定することに初めて成功した。このプロトン交換速度に基づき、細胞内の分子込み合い環境下と試験管内の希薄溶液環境下における核酸構造の安定性を評価した。この結果、細胞内環境においてはRNAが形成しているステム構造が試験管内環境よりも不安定化していることが示唆された。計画通り、さらに、試験管内で親水性のポリマーなどを用いて人工的に分子込み合い環境を再現し、核酸の構造安定性を評価した結果、細胞内において核酸の構造を不安定化させている要因を推定した。これらの結果はQHRやQTApなどの機能性核酸についても細胞内ではステム構造が不安定化する可能性を示唆している。このように、細胞内で働くことを指向した機能性核酸の開発において、in-cell NMR法を用いることで、細胞内における構造安定性の評価を可能にした。

Strategy for Future Research Activity

カリウムイオン応答性の機能性核酸であるQHRとQTApの改良を進める。試験管内において、親水性ポリマーおよび細胞破砕液を利用した疑似細胞内環境下においても活性のオン/オフが可能となるように配列の改良を行う。特に、in-cell NMR測定の結果、細胞内において核酸の構造安定性に影響を与えることが示唆された高濃度のタンパク質存在下での活性測定も新たに追加する。
また、in-cell NMR法を用いた細胞内の機能性核酸の構造および安定性評価についても引き続き進めていく。現在、モデルとして14塩基のRNAを用いて細胞内における構造安定性を評価することに成功した。次の段階として、実際にQHRまたはQTApを用いてヒト生細胞内における構造安定性評価を行う。

Causes of Carryover

平成30年度に行ったin-cell NMR法の条件検討において、生理的な温度である37℃での測定には気泡の除去や酸素の供給等、測定方法や装置の再最適化が必要であることが分かり、これらの検討を行った。この計画変更のために、平成30年度に予定していた種々の配列の核酸を設計、購入し、カリウムイオン応答性核酸を細胞内環境用に最適化していく段階を31年度に行うこととし、このための予算を次年度使用額として繰り越した。

Research Products

• [Journal Article] The anti-prion RNA aptamer R12 disrupts the Alzheimer’s disease-related complex between prion and amyloid β (2019)
  • Author(s): Mamiko Iida, Tsukasa Mashima, Yudai Yamaoki, Masatomo So, Takashi Nagata and Masato Katahira
  • Journal Title: FEBS Journal Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: doi:10.1111/febs.14819
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] ヒト生細胞中における核酸NMRシグナルの初計測 (2019)
  • Author(s): 山置佑大, 永田崇, 片平正人
  • Journal Title: 生物物理 Volume: 59 Pages: 18-20
  • DOI: DOI: 10.2142/biophys.59.001
  • Open Access
• [Journal Article] Analysis of interactions between telomeric i-motif DNA and a cyclic tetraoxazole compound (2018)
  • Author(s): Shadi Sedghi Masoud*, Yudai Yamaoki*, (*equally contributed), Yue Ma, Adrien Marchand, Fernaldo Richtia Winnerdy, Valerie Gabelica, Anh Tuan Phan, Masato Katahira and Kazuo Nagasawa
  • Journal Title: ChemBioChem Volume: 19 Pages: 2268-2272
  • DOI: DOI:10.1002/cbic.201800425
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Multiplicity in long noncoding RNA in living cells (2018)
  • Author(s): Kurokawa, R., Komiya, R., Oyoshi, T., Matsuno, Y., Tani, H., Katahira, M., Hitachi, K., Iwashita, Y., Yamashita, T., Kondo, K., Yoneda, R., Yamaoki, Y., Ueda, N., Mashima, T., Kobayashi, N., Nagata, T., Kiyoishi, A., Miyake, M., Kano, F., Murata, M., Hamad, N., Sasaki, K. and Shoji, S.
  • Journal Title: Biomedical Sciences Volume: 4 Pages: 18-23
  • DOI: DOI: 10.11648/j.bs.20180402.11
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] In-cell NMR法によるヒト細胞内DNAおよびRNAの観測 (2018)
  • Author(s): 山置佑大
  • Organizer: 第2回長鎖非コードRNA勉強会
• [Presentation] In-cell NMR法によるヒト細胞内DNAおよびRNAの観測 (2018)
  • Author(s): 山置佑大
  • Organizer: 第19回若手NMR研究会
  • Invited
• [Presentation] Conformational change detection of translocated in liposarcoma, TLS, upon binding to promoter-associated non-coding RNA, pncRNA (2018)
  • Author(s): Nesreen Hamad, Tsukasa Mashima, Yudai Yamaoki, Keiko Kondo, Hiroki Watanabe, Takayuki Uchihashi, Riki Kurokawa, Takashi Nagata, Masato Katahira
  • Organizer: International Conference on Biochemistry, Molecular Biology and Biotechnology 2018 (ICBMBB2018)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Observation of imino proton signals of DNA and RNA introduced inside the living human cells by using in-cell NMR spectroscopy (2018)
  • Author(s): Yudai Yamaoki, Takashi Nagata, Ayaka Kiyoishi, Masayuki Miyake, Fumi Kano, Masayuki Murata, Masato Katahira
  • Organizer: XXVIII International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems (ICMRBS2018)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] In-cell NMR studies on structure and dynamics of DNA and RNA introduced inside the living human cells (2018)
  • Author(s): Yudai Yamaoki, Takashi Nagata, Ayaka Kiyoishi, Masayuki Miyake, Kuan-Heng Lin, Shohei Takami, Fumi Kano, Masayuki Murata, Masato Katahira
  • Organizer: The 45th International Symposium on Nucleic Acids Chemistry (ISNAC2018)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] In-cell NMR法を用いたヒト生細胞内のDNAおよびRNAの構造とダイナミクスの解析 (2018)
  • Author(s): 山置佑大, 永田崇, 清石彩華, 三宅雅之, 加納ふみ, 村田昌之, 片平正人
  • Organizer: 第57回NMR討論会
• [Presentation] In-cell NMR法によるヒト生細胞内環境下の核酸の解析 (2018)
  • Author(s): 山置佑大, 永田崇, 清石彩華, 三宅雅之, Lin Kuan-Heng, 高見昇平, 加納ふみ, 村田昌之, 片平正人
  • Organizer: 核酸化学若手フォーラム2018
• [Presentation] In-cell NMR analysis for structure and dynamics of nucleic acids introduced inside the living human cells (2018)
  • Author(s): Yudai Yamaoki, Takashi Nagata, Ayaka Kiyoishi, Masayuki Miyake, Kuan-Heng Lin, Shohei Takami, Fumi Kano, Masayuki Murata, Masato Katahira
  • Organizer: The 41st Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan
• [Presentation] Evaluation of the structural stability and dynamics of nucleic acids inside the living cells by using in-cell NMR spectroscopy (2018)
  • Author(s): Takashi Nagata, Yudai Yamaoki, Masato Katahira
  • Organizer: The 18th Annual Meeting of the Protein Science Society of Japan
  • Invited
• [Remarks] 京都大学エネルギー理工学研究所 エネルギー構造生命科学研究分野 片平研究室
  • URL: http://www.iae.kyoto-u.ac.jp/bio/