2017 Fiscal Year Research-status Report
分泌型Siglec-9とMCP-1による単球系細胞の炎症組織再生型移行機構の解明
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17K15720
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
橋本 登 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学系), 助教 (90712365)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 抗炎症 / 組織再生機構 / マクロファージ / Siglec-9 / 糖鎖 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
分泌型Siglec-9とMCP-1による単球系細胞の炎症組織再生型移行機構の解明のために、以下の検討を行った。
マウスマクロファージ由来細胞株RAW264.7、マウス腹腔マクロファージ、M-CSFで誘導したヒト正常単球由来マクロファージに対する分泌型Siglec-9の抗炎症効果を検討した。その結果、分泌型Siglec-9はIFNgammaとLPSによる炎症性サイトカインの誘導を抑制することがわかった。このことから炎症組織においてSiglec-9単独でも炎症抑制が引き起こされることが明らかになった。
ブレオマイシン誘導マウス間質性肺炎モデルにおいて分泌型Siglec-9とMCP-1は体重減少を抑制し、肺組織の改善を誘導することがわかった。(大学院生との共同研究) さらに、その時に肺組織においてM2型のマクロファージの集積と炎症状態の抑制、肺胞内細胞の抗炎症効果を見出した。現在論文作成中である。
これまでにCCR２上の糖鎖を介してSiglec-9が相互作用することがわかっている。現在、高効率なM2マクロファージの誘導法の検討を行なっており、条件が決まりしだいCCR2上の糖鎖の構造を解析する。また、今後は他のSiglec-9リガンド糖鎖キャリア分子の同定も行い、炎症組織再生型移行機構の解明を行なっていく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
糖鎖構造解析が進んでおらず、条件検討が難航している。間質性肺炎モデルにおける効果の検討は進んでいるが、劇症肝炎モデルの検討が終わっていない。現在、他のモデルも検討中である。
最近、他の研究グループから分泌型Siglec-9がT細胞の一種であるTh17への分化を抑制し、抗炎症効果を示すという報告があった。(Wang et al., 2017) そのため我々のモデルにおいても早急に検討する必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
分泌型Siglec-9とMCP-1による炎症組織再生型移行を解明するために、その中心となる糖鎖構造を質量分析によって解析し、構造決定を行う。これまでの研究によりCCR2上のN型糖鎖がSiglec-9のリガンド糖鎖になりうることがわかっている。また種々のレクチンによるCCR2上N型糖鎖の構造解析からa2-3結合のシアル酸を含むことも示唆されている。まずは単球系由来CCR2、Tag付きCCR2、組換えCCR2を調整・精製し、質量分析計を用いで糖鎖構造を解析する。またリガンド糖鎖合成責任酵素遺伝子を同定するために、CRISPR/Cas9システムを用いシアル酸転移酵素ST3GalIVとST3GalVI、複合型N型糖鎖伸長に必須なGlcNAc転移酵素MGAT IのKO細胞株をヒト単球様細胞株THP-1を用いて樹立し解析を行う。
ヒトCCR2上N型糖鎖付加ポテンシャルサイトは14番目のアスパラギンのみである。そこでそのアスパラギンの点変異CCR2発現ベクターやCRISPR/Cas9によるKnock-in法によりM2誘導におけるN型糖鎖の重要性を培養細胞の系で解明する。a2-3結合シアル酸特異的SialidaseやN型糖鎖切断酵素PNGaseを用い、その後sSiglec-9/MCP-1によるM2誘導が可能かを形態学的観察やM2マーカー分子(CD206, IL-10, Ym-1, arginase-1)の遺伝子発現変動を解析することにより検討する。さらにSiglec-9/MCP-1による組織再生機構の中でT細胞への影響も確認する。
現在、間質性肺炎モデルと劇症肝炎モデルを用い検討しているが、ovalbuminによる皮膚炎モデルなどでも検討する。
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| Causes of Carryover |
研究にやや遅れが生じたため、最も研究費がかかる質量分析が次年度に移った。次年度では質量分析に加え、マイクロアレイ等研究費がかさむことが予定されているので、この研究費は妥当である。
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