2018 Fiscal Year Research-status Report
新規安定型アスコルビン酸プローブによる植物アスコルビン酸結合タンパク質の探索
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17K19239
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| Research Institution | Shimane University |
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Principal Investigator |
石川 孝博 島根大学, 学術研究院農生命科学系, 教授 (60285385)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田井 章博 県立広島大学, 生命環境学部, 教授 (70284081)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| Keywords | アスコルビン酸プローブ / プロテオーム / シロイヌナズナ / アスコルビン酸結合タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度までに、研究分担者田井博士のグループにより合成されたアスコルビン酸プローブを用いて作製したアフィニティーカラムにより、シロイヌナズナアスコルビン酸欠乏変異体vtc2から単離した45タンパク質に加え、今年度は新たにタンパク質抽出条件およびカラムへの結合・溶質条件を検討することで、さらに複数個のアスコルビン酸結合タンパク質候補を得た。得られた候補タンパク質についてさらにアスコルビン酸結合性を詳細に評価するため、各タンパク質のcDNAを調整後、大腸菌発現ベクターに導入し各組換え体タンパク質を作製した。アフィニティーカラムを用いて各タンパク質の結合性を再評価した結果、アスコルビン酸特異的に結合することが強く期待される候補として２つのタンパク質の選抜に成功した。当初の計画では、年度内に組換え体タンパク質による機能評価までを完了させる予定であったが、半数近くのタンパク質は大腸菌をホストとした場合、難発現性あるいは不溶性となるなどの問題が生じた。そのため、大腸菌による組換え体タンパク質の調整が難航したタンパク質については別途発現系の再検討を進めた。選抜した２つのタンパク質については、14C標識アスコルビン酸を用い結合定数の評価が進行中である。またさらに、これらタンパク質の生理的役割を明らかにするために、現在目的遺伝子の過剰発現系の構築をシロイヌナズナで進めるとともに、同T-DNA挿入による目的遺伝子破壊株を入手してホモ体の選抜が進行中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画では、アスコルビン酸プローブを用いて作製したアフィニティーカラムにより選抜したアスコルビン酸結合タンパク質候補について、年度内に組換え体タンパク質による機能評価までを完了させる予定であったが、多くのタンパク質において大腸菌をホストとした組換え体タンパク質として難発現性あるいは不溶性となるなどの問題が生じた。この点は評価としてマイナスではあるが、これは計画当初よりある程度想定していた予測の範囲内である。それ以上に、今回新規のアスコルビン酸結合タンパク質を見出した点は大きな成果であり、計画通りであるが、当初予定していたシロイヌナズナ遺伝子破壊株による目的タンパク質の機能評価にまでは至っていないことから、自己評価としておおむね計画通り進行していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
アスコルビン酸プローブによるアフィニティーカラムの条件を検討することで、機能未知を含めた新規のタンパク質候補の単離に至っているが、さらにアスコルビン酸による未知の役割を解明するために、今後特に検討すべきはバクテリア発現系において難発現性あるいは不溶性となった組換え体タンパク質発現系の検討である。今後は大腸菌以外の酵母やバキロウイルスによる発現系について検討を進めることで問題の解決を図る。また新規アスコルビン酸結合タンパク質の生理機能評価のため。遺伝子破壊株の単離および過剰発現体の作出を進めてゆく方針であり、植物におけるアスコルビン酸の新奇生理機能を明らかにできることが期待される。
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| Causes of Carryover |
当初予定通りアスコルビン酸プローブを用いて相互作用タンパク質を順調に単離していた。その後候補タンパク質の数が多く、組換え体タンパク質によるアスコルビン酸結合性評価に当初の計画以上の時間が掛かっている。またアスコルビン酸プローブに関しても条件を検討することで新規のタンパク質候補の単離にもいたっており、これらを精緻に分析し結論を導くため次年度使用額が生じている。
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[Journal Article] Affinity resins as new tools for identifying target proteins of ascorbic acid.2018
Author(s)
Iwaoka, Y., Nishino, K., Ishikawa, T., Ito, H., Sawa, Y., Tai, A.
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Journal Title
Analyst
Volume: 143
Pages: 874-882
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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