Identificatin of discus nursing facitors and application to fish production

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K19290
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 豊原 治彦 京都大学, 農学研究科, 准教授 (90183079)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 前川 真吾 京都大学, 情報学研究科, 助教 (30467401)
• Project Period (FY): 2017-06-30 – 2021-03-31
• Keywords: ディスカス / ディスカスミルク / 哺育因子 / 免疫グロブリン

Outline of Annual Research Achievements

RNAシーケンス解析により哺育期と非哺育期のそれぞれの皮膚粘液の転写産物を比較した結果、非哺育期に比べ哺育期に発現が減少したのは12遺伝子であったのに対し、上昇したのは160遺伝子と多く、ディスカスの親魚は仔魚の育成のために多くの新規遺伝子の発現を誘導していることが明らかとなった。哺育期に発現が誘導された遺伝子を解析した結果、上位には複数の免疫グロブリン関連遺伝子が含まれていた。またGO解析の結果、免疫系に関わる遺伝子群の変動が顕著であった。この結果、従来のディスカスミルクの研究では見過ごされていた免疫グロブリンが、真の哺育因子のひとつである可能性が示唆された。
ディスカス成魚組織のin situ hybridization解析により免疫グロブリンmRNAの発現を調べた結果、哺育期成魚の表皮において非哺育期成魚の表皮では見られない散在性のシグナルが多数観察された。この結果は、RNAシーケンスで得られた哺育期の成魚の皮膚において免疫グロブリンのmRNAの発現が誘導されたという結果を裏付けるものであった。発現誘導されたmRNAは表皮内に散在的に発現していたことから、何らかの顆粒内において特異的に発現している可能性が示唆された。次に、免疫グロブリンのタンパク質レベルでの発現を確認するために、免疫組織学的ならびに生化学的分析を行った。哺育期と非哺育期の成魚の皮膚における免疫グロブリンの発現を比較したところ、意外なことに免疫染色によってもウエスタンブロットによっても免疫グロブリンのタンパク質レベルの発現に差は見られなかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでの報告で種々の物質が哺育因子の候補として示唆されてきたが、具体的にどの成分が仔魚の生残率の向上に寄与しているのかに関しては未だ特定されていない。その一因として哺育因子を網羅的に探索するということが技術的に不可能であったため、これまでの研究においては特定の成分や物質に対しての解析のみが行われ、また哺育因子の候補と予想された成分について仔魚体内での動態について検討されていないことが挙げられる。
本研究では、ディスカスミルクに含まれる哺育因子の特定を目的として、遺伝子発現を網羅的に解析できる次世代シーケンサーを利用したRNAシーケンス解析によりディスカス親魚の粘液中で誘導される遺伝子の探索を行った。その結果、哺育因子の候補として免疫グロブリンを見出し、その仔魚体内での動態から免疫グロブリンがこれまで長年にわたって探し求めていた哺育因子である可能性を見出すことに成功した。

Strategy for Future Research Activity

今年度、哺育期にあるディスカス親魚の皮膚から分泌されるディスカスミルクについて、その本体が免疫グロブリンのmRNAであることを発見したが、その翻訳産物である免疫グロブリンタンパク質を検出することができなかった。今後、免疫グロブリンを用いた免疫組織学的実験などを追加し、ディスカスミルクにタンパク質としての免疫グロブリンが含まれているかを確認する必要があると考える。
さらに、健苗育成が困難なウナギなどの魚種について、リポソームなどを利用したmRNAとしての免疫グロブリン投与の効果を検討することも、水産増養殖の観点から推進する必要があると考える。

Causes of Carryover

今年度、哺育期にあるディスカス親魚の皮膚から分泌されるディスカスミルクについて、その本体が免疫グロブリンのmRNAであることを発見したが、その翻訳産物である免疫グロブリンタンパク質を検出することができなかった。そのため実験期間を１年間延長し、免疫グロブリンを用いた免疫組織学的実験などを追加し、ディスカスミルクにタンパク質としての免疫グロブリンが含まれているかを確認するため。