2019 Fiscal Year Research-status Report
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17K19694
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
大石 久史 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (30375513)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2021-03-31
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| Keywords | 糖尿病 / インスリン / リプログラミング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
(1)インスリン転写を体外から非侵襲にモニター可能なスクリーニング系の確立:生体発光を用いて非侵襲的に繰り返し検出し，定量可能なスクリーニング系を構築した。これまでに、マウスインスリン1プロモーター下にルシフェラーゼ遺伝子が誘導されるレポーターマウス(MIP-Lucマウス)を作製したが、このマウスにβ細胞関連転写因子であるPdx1、NeuroD、MafAの3遺伝子の導入によって、最も強力にインスリン転写を誘導可能なことを確認した。
(2)スクリーニング系を応用したβ細胞変換因子の網羅的解析:上記3遺伝子をレポーターマウスの肝臓に導入したところ、インスリン発現は一過性で、誘導後数週間で肝臓細胞に戻った。また、明らかなグルコース応答性を認めなかったため、この2つの問題点を克服し、更なる効率的なDRを誘導する ために、MIP-GFPマウスの肝臓に、上記3遺伝子を導入し、導入後1週、2週で、肝GFP陽性細胞のマイクロアレイ解析を行い、Q-PCRで確認を行った。いくつかの新たなリプログラミング因子の候補を同定し、その発現アデノウイルスを作製し、先の3遺伝子とともにMIP-Lucマウスに導入したところ、Isl1遺伝子が、有意にインスリン転写を促進することが明らかとなった。またSTZ糖尿病モデルに対しても、Ins1遺伝子導入による有意な血糖値改善効果が認められた。一方で、インスリン分泌の期間については明らかな改善を認めず、ex vivoにおけるグルコース応答性獲得は得られなかった。
(3)ヒト肝臓細胞を持つキメラマウスに対して、マウス肝臓からヒトアルブミンの遺伝子発現を認め、移植細胞の生着が確認できた。このマウスに、β細胞変換因子を導入したところ、ヒトインスリン遺伝子発現を認め、ヒト糖尿病治療への応用可能性を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前述の通り、本研究課題は、(1)インスリン転写を体外から非侵襲的にモニター可能なスクリーニング系の確立、(2)スクリーニング系を応用したβ細胞変換因子の網羅的解析、(3)マウス内にヒト肝臓細胞が生着したキメラマウスを使ったヒト細胞のダイレクトリプログラミングの3点を達成するものである。令和元年度末までに(1)(2)を終え、本課題で作製されたMIP-Lucマウスは、別施設の共同研究者でもβ細胞のモニター動物として使用されている。また(2)として、網羅的遺伝子発現解析から新規のβ細胞変換因子Ins1の同定に成功した。Ins1を新たに遺伝子導入してβ細胞誘導を行ったところ、従来と比較して有意にインスリン発現量の増加を認めた。(3)について、これまでに、重度免疫不全マウスであるNOGマウスに、ヒト肝細胞を経脾臓的に移植を行ったところ、マウス肝臓からヒトアルブミンの遺伝子発現を認め、移植細胞の生着が確認できた。このマウスに、β細胞変換因子を導入したところ、ヒトインスリン遺伝子発現を認め、in vivoにおけるヒト肝細胞のリプログラミングの可能性を見出しており、当初の終了予定である平成31年度末を1年延長して、後述の実験を追加する。
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| Strategy for Future Research Activity |
糖尿病は、インスリンの絶対的・相対的不足により、グルコースを効率良く利用出来ない ことが病態の本質である。令和2年度を研究最終年度として、計画の最終実験である「マウス内にヒト肝臓細胞が生着したキメラマウスを使った、ヒト細胞のダイレクトリプログラミング」を実施する。これまでに、NOGマウスへのヒト肝細胞生着を確認し、キメラマウスの安定的作成に成功している。今後、これらのマウスに対して、β細胞変換因子を導入し、遺伝子プロファイル、特にヒト肝細胞およびβ細胞に関わる遺伝子発現の変化とタンパクレベルでのインスリン解析を追加して、計画の全行程を終了する。一方、別の実験によりホスホリパーゼA2の阻害剤であるPolydatinがβ細胞保護作用、特に高血糖ストレス下における抗酸化作用を持つことを見出している。肝臓内に誘導されたインスリン発現細胞に対するPolydatinの細胞保護作用を検討することで、リプログラミング効率化への作用を実証する。
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| Causes of Carryover |
計画の最終実験である「マウス内にヒト肝臓細胞が生着したキメラマウスを使った、ヒト細胞のダイレクトリプログラミング」研究に使用する。すなわち、ヒト肝細胞生着が確認されたNOGマウスに対して、β細胞変換因子を導入し、遺伝子プロファイル、特にヒト肝細胞およびβ細胞に関わる遺伝子発現の変化とタンパクレベルでのインスリン解析に使用する。また肝臓内に誘導されたインスリン発現細胞に対するPolydatinの細胞保護作用の検討について、使用する。
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