The creation of the de novo vector for the newly Cell Delivery System (CDS)

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K20103
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 光永 佳奈枝 京都大学, iPS細胞研究所, 特定拠点助教 (10398240)
• Project Period (FY): 2017-06-30 – 2021-03-31
• Keywords: フリーアミン / FACS / HM / BTK / 培養 / 遊走

Outline of Annual Research Achievements

この研究では、筋ジストロフィー症などの全身性難病の治癒を目標とし、再生医療において夢の技術とされる治療細胞を全身へ運ぶ運び屋（ベクター）を作成する。現在の移植技術では局所的な移植をする他はなく、全身性の疾患の場合、全身の治癒を目的とした細胞移植は困難となる。
筋肉への遊走性が高く、筋組織に寄与し、構造的に細胞を包接しうるミクソゾア類に着目し、その細胞の単離と培養系の開発、遊走性の有無の解析を行なった。
ミクソゾア類が寄生しうる、市販の刺身である宿主材料、HM：ヒラメ、マグロ（flounder,tune:HM）、BTK:鰤、鯛、鰹 （yellow tail,sea bream and bonito：BTK）を材料とし、フリーアミンを用いてFACSで単離した。1回のSoringで約2000個程の細胞が回収できるため、それを既存の培養細胞またはマウスからCD抗原を用いて純化した初代培養細胞上に細胞体をまき、共存培養を行なった。その結果Sorting後の生存率を保つことができた。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

当初の予定ではミクソゾア類を大量に単離し、ゲノム解析及びイメージング解析、筋組織への遊走実験にを進める予定であったが、フリーアミンの細胞集団の陽性率が全体の１％以下になるため、その他の組織、細胞のコンタミネーションが多く、解析には用いることができなかった。またSortingの時間が長く、一度に次の実験へ移ることができず、解析が次の日となってしまう。そのため、培養細胞上にまくことにより、細胞体の生存率をあげ、効率よく実験が行える、培養系を立ち上げた。どのような培養細胞上にまくかの検討中であり、生存率と細胞への寄与を考慮しながら、その後の単離のために培養細胞の表面抗原を用いて、ミクソゾア類以外の細胞を除き、Purityをあげる実験を試行中である。また遊走実験に用いる細胞種とその遊走を観察するシャーレの開発に移行することができなかったため、計画の最初の採取する段階を継続している。

Strategy for Future Research Activity

魚に寄生するミクソゾア類は1000種類以上存在するが、フリーアミンを用いてFACSでSoritngできる種類は、ある程度限られていると推測される。その理由として、FACSでは最初に前方散乱光（FSC)と側方散乱光（SSC)を最初のP1ゲートとして囲み、それらは小さく細胞集団となってドットプロット上に現れることと、イメージストリームで解析した際には、最初にターゲットとした細胞体以外のフリーアミン陽性の細胞体がみられない。
またゲノム解析、遊走実験を行なうにあたって、やはりミクソゾア類の細胞体の生存率と解析が可能となる細胞数が必要であるため、培養により採取した細胞体を維持し、その後の実験に用いることが必須であった。
そのため、既存の細胞培養上、とCD抗原で分けられるマウスの初代培養の細胞上にミクソゾア類の細胞体をまくことにより、解析に十分な細胞体を得ていくこととした。過去の文献からヒトの結腸がん由来の培養細胞上で毒性試験をおこなっている研究を参考に、複数種類の培養細胞を用いて、ミクソゾア類を培養する実験を行なう。またマウス組織の初代培養では、c-kit陽性細胞（接着細胞）、CD45陽性細胞（浮遊細胞）を磁器ビーズを用いて純度をあげ、Soritng後にミクソゾア類のフィーダーとして使用する計画である。