細菌人工染色体による緑色蛍光蛋白質遺伝子導入マウス作成とStAR遺伝子発現解析

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18591167
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 石井 智弘 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (70265867)
• Keywords: steroidogenic acute regulatory protein / ステロイドホルモン / 細菌人工染色体 / 緑色蛍光蛋白質 / マウス

Research Abstract

本研究はsteroidogenic acute regulatory protein (StAR)のステロイドホルモン生合成におけるコレステロール転送機構を解明することを最終的な目標とし,in vivoにおけるStAR構造機能解析系の確立を目指すものである.当該期間においては,下記の経緯で,野生型マウスStar遺伝子を含む細菌人工染色体(Star WT BAC)をrecombinase A発現大腸菌内で相同組み換えにより修飾し,Star遺伝子転写調節領域により誘導される緑色蛍光蛋白質(eGFP)レポーター遺伝子導入マウス(Star/eGFPマウス)のコンストラクトを完成させた.
1)Star遺伝子翻訳開始コドンの上下流500bpの相同領域A, BでeGFP cDNA, bGH polyAを挟んだ2kbの領域をrecombinase A,テトラサイクリン耐性遺伝子,温度感受性oriを持つpSV1.RecAヘライゲートし,シャトルベクターpSV1.RecA.A.eGFP.bGHpolyA.Bを作成した.
2)StarWTBAC導入大腸菌にシャトルベクターpSV1.RecA.A.eGFP.bGHpolyA.Bを導入し,クロラムフェニコール,テトラサイクリン,温度感受性で選択して,Star WT BACの相同領域AないしBへpSV1.RecA.A.eGFP.bGHpolyA.Bが挿入されたco-integrated BACを同定した.
3)Co-integrated BACをクロラムフェニコールと温度感受性で選択し2回目の相同組み換えを誘導して,さらにクロラムフェニコールとフサル酸感受性で選択してStar/eGFP BACを同定した.
4)Star/eGFP BACのサイズ・構成をPFGE・サザンプロット・シーケンスで確認し,CsCl密度勾配遠心法で精製し,Star/eGFPマウスのコンストラクトとした.