2006 Fiscal Year Annual Research Report
敗血症由来の中枢神経障害におけるHMBG-1の関与
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18591688
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
門井 雄司 群馬大学, 医学部, 助教授 (10292591)
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| Keywords | 敗血症 / 脳症 / エンドトキシン / HMGB-1 |
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| Research Abstract |
敗血症での、1. Immunohistochemistry法を用いた脳内HMGB-1の発現部位の決定、2.脳内Rho kinaseとMAP kinaseの活性をWestern Blot法で定量を検討した。
1. Immunohistochemistry法を用いた脳内HMGB-1の発現部位の決定
wistar系Rat(250-300g)を用いてpentobarbital麻酔下に、盲腸穿孔モデルを作成。24時間後にイソフルラン麻酔下にRat脳を4%ハラホルムアルデヒドで還流固定。固定2時間後にRat脳を取り出し、クライオスタット(Leica CM1900)を使用して10μmの脳スライスを作成。作成した脳スライスにABC法を用いたImunohistochemistry法で測定。
2.脳内Rho kinaseとMAP kinaseの定量
上記で作成した脳スライスに対してHMGB-1が多く発現する部位を取り出し、0.32M sucroseを10倍量加えた後、Potter型ホモジナイザーを利用して、脳組織をホモジネートを行う。ホモジネートした組織はBeckman遠心器を利用して100、000x g.60分でP2分画に精製分離。その精製したP2文画を利用してSDS-PAGEとImmunobotting法(Western Blot法)を用いてMAP kinaseの定量。20μgに分割したP2分画を電気泳動(Boi-Rad社製Immune Blot Kit)に流してMAP kinaseを分離し、それをNitrocellulose膜に転写。200倍に希釈した1次抗体である抗MAP kinase抗体,Rho kinase(Sigma社製品)を投与し、Avidin-Biotin Complex(ABC kit:アマシャム社製)を投与し発色させた。
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