2006 Fiscal Year Annual Research Report
RNAiを用いた軽度低温の脳浮腫抑制効果に果たす水チャンネル機能の解析
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18591714
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
藤田 義人 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 助教 (90238593)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
浅井 清文 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (70212462)
祖父江 和哉 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (90264738)
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| Keywords | RNAi / アクアポリン / 脳浮腫 / 脳低温療法 / 水チャンネル |
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| Research Abstract |
本年度は、今後の研究の基礎とるアクアポリン(AQP)Knockdown細胞株の確立を重点に行った。
すでに論文発表があり、Western BlottingにてKnockdownが確認されているRNAiを生じさせる、DNA上の3箇所の塩基配列につき、shRNAをつくるよな64merのconstructを作成したうえ、vectorに導入した。shRNAを発現するvectorには、神経系の細胞のRNAiで定評のあるinvitrogen社製のBlock-IT Pol II miR RNAi expression vector、pcDNA 6.2-GW/miRを使用した。そのプラスミドを大腸菌にtransformationして、大量培養し、Quiagen社のキットを用いて、目的となるconstructを含むプラスミドを大量に、無菌的に精製した。さらに文献上のAQP4のRNAi用の3つのconstructに加え、申請者オリジナルのRNAi用のconstructを3つ、文献などによりRNAiを起こしやすい条件を参考に決定し、vectorに挿入した形で同様に大量に精製した。
アストロサイトにtrasnfectionする方法として、リポフェクションを利用した、タカラバイオ社製Trans-IT Neuralを使用した。ただ、現段階ではtransfectionの効率が非常に悪く、10%以下となっている。このことに関して、transfection効率の最もよくなると考えられる条件を、mediumの組成や、transfection reagentの量、vectorの量などの最適条件を検討中である。思ったような効率が得られない場合には、PC12 cellなどに用いて比較的高いtransfection効率を得ている、エレクトロポレーションなどの別のtransfectionの方法も検討する予定である。
Transfectionの効率など、これらの諸条件を最適なものとすることは、今後の実験の効率にとってcriticalのものであり慎重に検討する必要があると考えている。大方満足のいくRNAiを得ることができれば、実際の低温における脳浮腫効果の解明に用いていく予定である。
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