2018 Fiscal Year Annual Research Report
金属ナノ粒子によるタンパク質ドメインの高速高精度イメージング技術の開発
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18H01904
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| Research Institution | Institute for Molecular Science |
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Principal Investigator |
安藤 潤 分子科学研究所, 生命・錯体分子科学研究領域, 助教 (40623369)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 金属ナノ粒子 / 1分子イメージング / タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
金・銀ナノ粒子をプローブに用いた、デュアルカラーイメージング法の開発を行った。各粒子の共鳴波長に合致した2本のレーザー光を照明光に用い、散乱効率の違いによって金・銀ナノ粒子を識別・可視化する。
まず、金・銀ナノ粒子の散乱スペクトルを取得して照明光の波長を選定し、全反射型のデュアルビュー暗視野顕微鏡を構築した。対物レンズ直下に穴あきミラーを配置し、エバネッセント場による試料の2色同時照明、及び穴あき部を介した散乱光の検出を行った。結像光学系の光路を波長毎に分岐した後、 検出器受光面の上下にそれぞれ結像した。ガラス基板上に固定した金・銀ナノ粒子を観察し、波長毎に識別・可視化できることを確認した。40nmの金ナノ粒子、30nmの銀ナノ粒子に対して、時間分解能1ミリ秒で約0.5nmの位置決定精度を達成した。
位置決定精度の下限値についても検証し、フォトン数の平方根に比例して精度が向上すること、40nmの金ナノ粒子で0.13オングストロームまで精度を向上できることを示した。時間分解能と位置決定精度の関係、粒径と信号強度の関係についても検証した。
金・銀ナノ粒子を生体1分子と結合させるため、ストレプトアビジンによる機能化を検討した。試薬の反応時間等を最適化し、安定して機能化粒子を得る手法を確立した。ビオチン化した脂質分子を含む人工膜を形成し、各粒子を結合して開発装置で観察した。金・銀ナノ粒子を識別しながら、時間分解能100マイクロ秒で膜中を拡散する脂質分子を追跡することに成功した。
さらにタンパク質試料として、モータードメインの片方にシステインを変異導入したキネシンの発現・精製を行った。変異導入部をビオチン化し、機能化した金ナノ粒子と結合させた。ガラス基板上に微小管を固定して暗視野顕微鏡で観察し、微小管に沿ったキネシンの直進運動と微小管の周期構造に合致したステップサイズを確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画どおり、金・銀ナノ粒子を光学顕微鏡のプローブに用いた、デュアルカラー暗視野イメージング法の開発を進めることができたため、おおむね順調に進展していると判断した。提案の通り、2色のレーザー光を用い、波長毎の散乱効率の違いから、金・銀ナノ粒子を分離・識別できることを実証できた。穴あきミラーとデュアルビュー結像光学系を用い、2色同時照明・検出を行う全反射型の暗視野顕微鏡を構築できた。高位置決定精度で計測を行うため、精度低下の要因となるレーザー光の揺らぎなどの要素を丁寧に取り除き、金・銀ナノ粒子のいずれも、サブナノメートルの高い位置決定精度を達成することができた。プローブの表面修飾法についても検討し、安定して機能化粒子を得る手法を確立できた。機能化粒子を用いて、脂質膜のデュアルビュー高速暗視野イメージングにも成功した。さらに、機能化粒子と結合させるため、変異導入したモータータンパク質キネシンの発現・精製も行った。モータードメインに金ナノ粒子を結合させ、キネシンの直進運動や微小管の周期構造と一致するステップサイズを計測できた。全体として、計画どおりに順調に研究を推進できていると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、金属ナノ粒子の近接によって生じるプラズモン共鳴波長シフトを検出する、マルチカラー暗視野顕微鏡の開発を計画している。金属ナノ粒子が近接してダイマーを形成すると、共鳴波長の長波長シフトが起こる。シフト量は近接距離に依存するため、プローブ間距離のナノ計測に利用できると考えられる。そこで、複数の金属ナノ粒子と、これらの近接に伴う共鳴波長シフトを捉えるマルチカラー計測装置を開発する。構築装置により、励起波長等の最適化やプローブの粒径等の検討、位置決定精度や時間分解能の検証を行う。さらに、機能化した金属ナノ粒子を結合させるため、特定のドメインに変異導入したキネシンの発現・精製を行う。上記の研究開発を推進し、金属ナノ粒子によるタンパク質の高速高精度イメージング研究を推進する。
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